失重對大鼠髁突軟骨細胞中TNF－αmRNA表達的影響*

金波濤，于紹冰，鄭衛衛，于 潔，曹 巖

失重環境能引起機體血液動力學的改變，從而使心血管系統和咀嚼肌、骨骼肌發生一系列適應性變化。近年來，有關失重狀態下，咀嚼肌的變化逐漸得到學者的關注，由此是否可以引起對顳頜關節病(temporomandibular disorders，TMD)國內外鮮有報道。為了進一步探討失重環境與TMD的關系，本研究擬采用尾部懸吊模擬失重大鼠模型，應用組織形態學方法，觀察失重不同時期對顳下頜關節(temporomandibular joint，TMJ)內相關炎性因子TNF－α的表達，以探討其在顳下頜關節病發病機制中的作用。

1 材料和方法

1．1 實驗動物分組和方法 SD大鼠，一級，60只，體重(150±10)g，雄性，由山東大學動物中心提供。大鼠在實驗室適應性飼養1周后，隨機分為4組，分別為懸吊1、3、5周及對照組，每組15只。懸吊組進行尾部懸吊［1］;對照組不做任何處理。動物實驗嚴格按照有關實驗室動物飼養及使用規則實施。各組大鼠在同一條件下以國家標準嚙齒類動物常規飼料單籠喂養，大鼠飼養籠具、飲水瓶定期消毒，使用墊料均經高壓滅菌。稱量大鼠體重1次/5 d，自由進水飲食，室溫維持在(21±2)℃，相對濕度45% ～55%，動物飼養房實行12 h光照與12 h黑暗交替循環。

1．2 軟骨細胞的分離 直視下切取髁突軟骨層，放入盛有無鈣平衡鹽液(D－Hanks液)的平皿中，眼科剪盡量剪碎，移入離心管內10倍量胰蛋白酶37℃振蕩，消化30 min，0．2%膠原酶II 37℃振蕩下消化2 h，10 ml混合培養基(含20%胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml，抗壞血酸50 U/ml)培養于37℃，5%CO2培養箱內，48 h后首次換液，以后隔天換液。透明軟骨細胞長成單層后，進行傳代，棄去培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，0．5%胰蛋白酶約10 ml消化5 min，DMEM混合培養基反復吹打成單細胞懸液，消化傳代至平底24孔培養板，每孔種植細胞數約5×10G個。

1．3 TNF－α含量測定 用ELISA法定量測定大鼠髁突軟骨細胞培養物上清TNF－α含量，嚴格按Promage公司試劑盒使用說明書操作。

1．4 總RNA提取 PBS0．01%mol/L，沖洗離心后加Catrimox－14AM等量簡單地粉碎細胞，GeneQuaant－pro-RNA/DNA定量RNA最后溶于RNA緩沖液中，吸取5 μl RNA樣品在20 μl反應體系中進行反轉錄反應，反應條件:水浴5 min，37℃水浴5 min，37℃水浴60 min及 70 min 加熱 10 min，PCR 反應體系為 50 μl，擴增條件為:變性94℃ 30 s，復性50℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，循環35次，凝膠成像分析系統觀察攝片。

1．5 髁突軟骨細胞分離純化 按常規方法以髁突軟骨細胞分離液分離靜脈血髁突軟骨細胞PBMC采用異硫氰酸胍一步法，嚴格按Promage公司試劑盒使用說明書操作。cDNA合成:0．5%焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理過的微量離心管中，依次進行。RT－PCR參數:TNF－α循環參數:94℃預變性3 min;變性94℃1 min，退火58℃115 min，延伸72℃2 min，循環30次;最后延伸2 min。引物設計如下:

TNF－α上游(5’－3’):AGG CGC TCC CCA AAA AGA TG;下游(5’－3’):TGG CGG AGA GGA GGC TGA CT。

β－actin上游(5’－3’):CTA TCG GCA ATG AGC GGT TC;下游(5’－3’):CTT AGG AGT TGG GGG TGG CT。

2 結果

TNF－αmRNA在懸吊1周表達最強，以后逐漸達到正常水平;懸吊1周組細胞因子mRNA升高最顯著，較懸吊3、5周2組有所下降并接近對照組。對照組變化不大，但與各懸吊組相比較明顯降低。見表1。

表1 各時點兩組TNF－αmRNA水平(n=15，±s)

表1 各時點兩組TNF－αmRNA水平(n=15，±s)

注:與對照組比較*P＜0．05

懸吊時間 對照組 懸吊組1 周 0．453 ±0．028 0．981 ±0．024*0．439 ±0．023 0．510 ±0．016 3 周 0．454 ±0．021 0．646 ±0．017 5周

3 討論

微重力或模擬失重環境會導致肌肉的結構、功能及電生理學特性發生一系列的變化，如肌肉趨于縮性改變［2］、收縮功能下降［1］、超微結構及生化特性的改變等［3］，但這些變化的分子機制尚不清楚。那么，與咬肌密切相關顳下頜關節是否會因為咬肌功能的變化而變化呢?從本文結果可以看出，這種模擬失重環境能夠引起顳下頜關節內炎性因子發生變化。

目前，TMD的確切病因和發病機制尚不明了，有研究發現顳下頜關節紊亂癥患者的關節局部組織產生大量細胞因子TNF－α等，然而這些細胞因子對關節軟骨細胞增殖、代謝和凋亡的作用機制和影響途徑迄今尚無定論［4］。TNF－α由單核吞噬細胞和其它類型細胞產生并作用于這些細胞來調節黏附分子、免疫球蛋Fc受體、一氧化氮合成和金屬蛋白酶產生及其它細胞因子分泌，同時促進結締組織和內皮細胞激活。其主要功能是致炎作用，并能直接或間接地介導骨組織吸收。已經有證據表明TNF－α在軟骨細胞的降解－退變過程中起到最重要的分解作用。本文結果說明懸吊1、3、5周時，TMJ髁突軟骨有嚴重的炎性反應，而隨著時間增加，炎性反應會漸漸減輕，這可能因為筆者的研究采取了單一的失重模式，大鼠漸漸適應了這種方式的原因。

細胞因子是低分子量蛋白質，是炎癥和免疫過程起始因子和效應器，其中TNF－β起重要作用。T細胞經抗原刺激后表達IL－1受體，在IL－1作用下被活化，從而分泌 IL－2、IFN、GM －CSF、IL－4等細胞因子，增加T細胞表面MHC2類抗原的表達，誘導細胞毒性T淋巴細胞的分化，誘導單核/巨噬細胞產生TNF，并通過單核細胞和巨噬細胞產生IL－8介導對中性粒細胞的趨化作用，加速血纖維蛋白原、C反應蛋白等的合成［5］。TNF－活化單核/巨噬細胞，提高其殺傷活性，釋放超氧、促進NO、IL－2等細胞因子的產生，促進中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞粘附到內皮細胞上，從而參與炎癥反應［6］。

［1］ZB，Zhang LF，Jin JP．A proteolytic NHZ －terminal truncation of cardiac troponin I that is up － regulated in simulated microgravity［J］．J Biol Chem，2001，276(19):15753 －15760．

［2］List T，Wahlund K，Larsson B．Psychosocial functioning and dental factors in adolescents with temporomandibular disorders:a casecontrol study［J］．J Orofac Pain，2001，15(3):218 －227．

［3］Zhang L，Wang YY，Yu ZB．Depressed responsiveness of cardiomyocytes to isoproterenol in simulated weightlessness rats［J］．Acta Physiol Sin，2007，59(6):845 －850．

［4］ Convertino VA．Status of cardiovascular issues related to space flight:Implications for future research directions［J］．Respir Physio1 Neurobiol，2009，169(Suppl 1):s34 － s37．

［5］Dalekos GN，Elisaf M，Bairaktarl E，et al．Increased serum levels of interleuk in－1 in the systemic circulation of patients with essential hyperten sive patients［J］．J Lab Clin Med，1997，129(3):300－305．

［6］Futrakul N，Buthep P，Patumarys，et al．Enhanced tumor necrosis factor in the serum and renal hyperfusion in nephrosis associated with focal segment glomerlo-sclerosis［J］．Ren Fail，2002，22(2):213－215．