反相高效液相色譜法同時測定皮膚墨水中間苯二酚和苯酚含量＊

王曉青，劉皈陽，馬建麗，吳海偉，賈燕花，徐超斗

(1．中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院藥劑藥理科，北京 100048;2．中國人民解放軍總后勤部衛生部藥品儀器檢驗所，北京 100071)

皮膚墨水是《中國醫院制劑規范》中收載的品種，臨床用于皮膚劃線，指示病灶范圍，便于治療[1]。目前，該品種的質量標準尚未建立含量測定項，與制劑的質量控制要求不符。為了更好地控制制劑質量，保障臨床用藥安全，筆者建立了同時測定該制劑中主要成分間苯二酚和苯酚含量的反相高效液相色譜(RP－HPLC)法，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Mettler AE240型電子天平(美國梅特勒－托力多公司)。間苯二酚對照品(批號為100389－201202，含量為100．0%)、苯酚對照品(批號為100509－201203，含量為100．0%)均購自中國食品藥品檢定研究院;皮膚墨水(長海醫院1批，批號為130628;解放軍總醫院第一附屬醫院2批，批號為131106，131111);甲醇(色譜純，Fisher公司);水為三蒸水。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱:Agilent zorbax SB －C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相:甲醇－水(40∶60);流速:1．0 mL/min;檢測波長:270 nm;進樣量:10 μL;柱溫:室溫。

2．2 溶液制備

精密稱取間苯二酚對照品36．2 mg、苯酚對照品17．1 mg，分別置50 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得含間苯二酚724 μg/mL、苯酚342 μg/mL的對照品貯備液;再分別精密量取上述貯備液各2．5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制得每 1 mL 含間苯二酚 36．2 μg、苯酚 17．1 μg 的混合對照品溶液。精密量取皮膚墨水樣品0．5 mL，置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，得供試品貯備液;精密量取供試品貯備液2．5 mL，置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按樣品處方及配制工藝，制備不含苯酚、間苯二酚的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2．3 方法學考察

專屬性試驗:分別取2．2項下3種溶液，按擬訂色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。結果見圖1?？梢?，供試品溶液與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應的色譜峰，且供試品各組分峰的理論板數均在5 000以上，分離度大于1．5，處方中其他組分對間苯二酚和苯酚的測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:分別精密量取含間苯二酚724 μg/mL、苯酚342 μg/mL 的對照品貯備液 1．5，2．0，2．5，3．0，3．5，4．0 mL 置50 mL容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，得不同質量濃度的混合對照品溶液。按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以質量濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，得回歸方程，間苯二酚為Y1=7．579 X1+1．789 5(r=0．999 8)，苯酚為 Y2=8．605 X1+1．476 7(r=0．999 9)。結果表明，間苯二酚和苯酚質量濃度分別在 21．6～57．6 和 10．3 ～27．4 μg/mL 范圍內與各自峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗:取每 1 mL 含間苯二酚 36．2 μg、苯酚 17．1 μg的混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6次。結果間苯二酚和苯酚的 RSD分別為0．07%和0．10%(n=6)，表明進樣精密度良好。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為131106)5份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。結果間苯二酚和苯酚的含量分別為標示量的100．41%和100．27%，RSD 分別為 0．60% 和 0．50%(n=5)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，4，8，12，18，24 h 時進樣測定，記錄色譜圖。結果間苯二酚和苯酚峰面積的 RSD分別為0．38%和0．35%(n=7)，表明間苯二酚、苯酚在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗:精密量取9份已知含量的樣品溶液(批號為131106)，依法制備供試品貯備液，取供試品貯備液各2．5 mL，置100 mL容量瓶中，再分別精密加入含間苯二酚724 μg/mL、苯酚342 μg/mL 的對照品溶液 1．5，2．5，3．5 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件進樣測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 間苯二酚及苯酚回收率試驗結果(n=9)

2．4 樣品含量測定

取3批樣品，按2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，按外標法以峰面積計算間苯二酚和苯酚含量。結果見表2。

3 討論

間苯二酚、苯酚結構相似，紫外吸收特性相近，故可采用HPLC法同時測定兩者的含量。取間苯二酚、苯酚對照品溶液在220～400 nm波長范圍內進行光譜掃描，間苯二酚結果為275 nm，苯酚為271 nm，參考文獻[2－4]，選擇270 nm作為檢測波長。

試驗中比較了在甲醇和水在不同比例的條件下，各組分的峰形和分離情況，最后確定采用甲醇－水(40∶60)為流動相。在此流動相條件下，各組分的峰形及分離度均理想，未見其他組分干擾。

在確定含量檢測方法后，又對方法的耐用性進行了考察。改變流速(±0．2 mL/min)、流動相比例(±2%)，更換色譜柱(Eclipse XDB －C18柱、Eclipse plus－C18柱)，對樣品含量測定的影響均較小，RSD均小于2%，表明方法耐用性良好。方法學考察結果表明，所建立的含量測定方法操作簡便、快速、準確、重復性好，可用于控制該制劑的質量。

表2 樣品含量測定結果(n=3)

[1]中華人民共和國衛生部藥政局．中國醫院制劑規范(西藥制劑第二版)[M]．北京:中國醫藥科技出版社，1995:17．

[2]范 菲，劉鵬鳴，李鋒武，等．HPLC法同時測定復方水楊酸溶液中四組分的含量[J]．藥物分析雜志，2011，31(11):2 185－2 187．

[3]周蓓瀛，李 楠，張鋼平，等．高效液相色譜法測定水楊酸醇溶液中水楊酸含量[J]．中國藥業，2009，18(16):38－39．

[4]崔 麗．RP－HPLC法同時測定復方間苯二酚洗劑中間苯二酚和苯酚的含量[J]．中國藥房，2011，22(21):2 000 －2 001．