反相高效液相色譜法測定普盧利沙星片中NM394含量及有關物質

賀延新，劉素玲

(廣東省深圳市平樂骨傷科醫院，廣東 深圳 518000)

普盧利沙星(NM441)是噻丁啶－喹啉羧酸衍生物(NM394)的脂溶性前體藥物，口服易吸收并水解成NM394，NM394選擇性分布于菌體內，抑制細菌DNA螺旋酶的活性，從而發揮廣譜抗菌作用，但NM394口服吸收較差[1]。NM394作為NM441的合成母體及降解產物，因此有必要控制產品中NM394的量，以保證普盧利沙星產品的質量。本試驗中采用反相高效液相色譜(RP－HPLC)流動相梯度洗脫法測定普盧利沙星中NM394含量及其他有關物質。

1 儀器與試藥

日本島津LC－2010AHT型高效液相色譜儀;FA2004型電子天平(上海精密科學儀器有限公司);CSB6L－1800型超聲波清洗器(天津考德斯科技有限公司);AD－DI30(UV)型超純水系統(上海訊輝環保科技有限公司)。普盧利沙星對照品(純度為99．4%)、NM394對照品(天津市漢康醫藥生物技術有限公司，含量為99．6%);普盧利沙星片(批號為 090720，090721，090722，廣州白云山制藥股份有限公司)，規格為100 mg普盧利沙星相當于NM394 100 mg;乙腈、三乙胺為色譜純，水為超純水，磷酸二氫鈉為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相:A為0．025 mol/L磷酸二氫鈉溶液(用三乙胺調pH至6．0)，B為乙腈，用流動相A－B(80∶20)洗脫至NM394的峰完全檢出約6 min，即換流動相A－B(60∶40)洗脫至普盧利沙星峰保留時間的 3 倍;流速:1．0 mL/min;檢測波長:276 nm;進樣量:20 μL。

2．2 溶液制備

取本品20片，研細，精密稱取適量(約相當于普盧利沙星50 mg)，置100 mL容量瓶中，加流動相B 50 mL，超聲處理5 min使溶解，加流動相A－B(60∶40)稀釋至刻度，搖勻、過濾，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流動相A－B(60∶40)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取NM394對照品適量，精密稱定，用流動相A－B(80∶20)溶解并稀釋成每1 mL中約含2 μg的溶液，作為NM394對照品溶液。

2．3 方法學考察

輔料干擾試驗:取處方量的輔料適量，置100 mL容量瓶中，用流動相A－B(60∶40)溶解并稀釋至刻度，濾過，量取續濾液，作為陰性對照溶液，依法進樣20 μL。結果見圖1A。

NM394與普盧利沙星對照試驗:取NM394、普盧利沙星對照品各適量，置100 mL容量瓶中，按2．2項下方法配制NM394對照溶液、陽性對照品溶液。取普盧利沙星片0．12 g，依法制成供試品溶液。取以上各溶液，依法進樣20 μL。結果見圖1B和圖1C。

破壞試驗:稱取本品細粉約0．12 g共3份，分別置100 mL容量瓶中，加入0．5 mol/L鹽酸溶液1 mL，放置1 h后依法測定(酸破壞);加入0．1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，放置1 h后依法測定(堿破壞);加入(1→10)雙氧水1 mL，放置10 min后依法測定(氧化破壞)。取本品適量，在(4 500±500)lx下光照10 d后，研細，取細粉約0．12 g，置100 mL容量瓶中，依法測定(強光破壞)。取本品適量，在105℃放置8 h后，研細，取細粉約0．12 g，置100 mL容量瓶中，依法測定(熱破壞)。破壞試驗色譜圖見圖2。

線性關系考察:精密稱取NM394對照品適量，用流動相AB(80 ∶20)溶解，配成 0．24 g/L 的溶液，分別精密吸取 0．5，1．0，2．0，4．0，8．0，12．0 mL，置 100 mL 容量瓶中，用流動相 A － B(80∶20)稀釋至刻度，搖勻。按測定方法進樣20 μL，以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標進行線性回歸，回歸方程為 Y=4 450．4 X －5．220 7，r=0．999 1(n=6)。結果表明，NM394 質量濃度在1．2～28．8 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

圖1 輔料干擾與對照試驗色譜圖

圖2 破壞試驗色譜圖

最低檢測限確定:精密稱取NM394和普盧利沙星對照品適量，分別用流動相A－B(80∶20)和流動相A－B(60∶40)溶解配制成 0．43 μg/mL 和 0．22 μg/mL 的溶液，進樣 20 μL，觀察主成分峰高度。當信噪比為3∶1時，計算得NM394、普盧利沙星最低檢測限量分別為 6．3 μg 和 2．8 μg。

溶液穩定性試驗:取2．2項下供試品溶液，分別放置0，2，4，6，8 h后，取樣測定NM394及其他雜質含量。結果表明，NM394及其他雜質含量與初始溶液相比無明顯變化，沒有降解產物出現，供試品溶液在8 h內基本穩定，RSD分別為1．7%和0．8%。

NM394回收率試驗:取處方量本品輔料約0．11 g，共9份，分別置100 mL容量瓶中。取NM394對照品約20 mg，置500 mL容量瓶中，加流動相A－B(80∶20)溶解并稀釋至刻度，搖勻;分別精密吸取4，5，6 mL各3份，分別加入9個輔料溶液容量瓶中，用流動相A－B(60∶40)溶解稀釋至刻度，制成80%，100%，120%濃度的供試品溶液;量取20 μL，依法進樣。結果低、中、高濃度回收 率 分 別 為 98．8% ，99．7% ，99．4% ，RSD 分 別 為 0．99% ，0．61% ，0．43% 。

供試品溶液濃度與有關物質測定結果相關性考察:稱取本品細粉適量，精密稱定，共3份(各約相當于普盧利沙星25，50，100mg)，分別置100 mL容量瓶中，依法測定。結果有關物質分別為0．34% ，0．36% ，0．35% ，RSD 為 2．8% 。溶液 的質量濃 度在0．25～1．0 g/L間與有關物質的含量有良好的相關性。

重復性試驗:稱取本品細粉約0．12 g，精密稱定，共6份，依法測定。結果NM394含量的 RSD為0．89%，表明方法重復性良好。

2．4 樣品含量測定

取3批樣品，依法測定。結果3批樣品中NM394含量分別為0．05% ，0．04% ，0．08% ，有 關 物 質 含 量 為 0．36% ，0．37% ，0．37%，表明NM394及有關物質均在限度內。

3 討論

普盧利沙星為脂溶性化學物質，在流動相中極易降解生成水溶性的NM394[3];因此溶解NM394的溶劑選流動相A－B(80∶20)，溶解樣品的溶劑選流動相A－B(60∶40)。二者所選的溶劑目前雖無法統一，采用2種溶劑，但可以保證樣品測定結果的穩定。

由色譜圖(圖1及圖2)可知，輔料無吸收峰，因此輔料對NM394及其他有關物質的測定無干擾;本品經酸、堿、氧化、強光、高溫條件的破壞試驗后，產生的雜質峰與主成分峰、NM394峰在本色譜條件下能夠有效分離，分離度符合要求。因此，該色譜系統測定本品中NM394及其有關物質的專屬性較強，可采用梯度洗脫法測定NM394及其他有關物質。

在普盧利沙星的測定色譜條件下，NM394成分的保留時間較短(幾乎無保留)，容易被系統產生的色譜峰干擾，所測NM394結果不穩定[2]。采用流動相梯度洗脫，NM394保留時間延長;主成分峰、NM394峰及其他各雜質峰均能有效分離，且分離度良好、專屬性較強、準確度高。因此，本色譜系統能夠準確測定普盧利沙星中的NM394和有關物質。

[1]Ozaki M，Matsuda M，Tomii Y，et al．In vivo evaluation of NM441，a new thiazeto －quinoline derivative[J]．Antimicrob Agents Chemother，1991，35(12):2 496－2 499．

[2]初 虹．HPLC法檢查普盧利沙星有關物質[J]．藥學進展，2004，28(9):424－427．

[3]程秀民，馬淑濤，塵學蘭，等．普盧利沙星的HPLC測定[J]．中國醫藥工業雜志，2004，35(11):682 －683．