穿山龍提取物的純化工藝研究△

劉斌，高文學，刁興彬

(山東省泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000)

中藥工業

穿山龍提取物的純化工藝研究△

劉斌，高文學*，刁興彬

(山東省泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000)

目的研究并建立穿山龍提取物的純化工藝。方法以總皂苷和薯蕷皂苷綜合評價為指標，利用大孔吸附樹脂純化穿山龍提取物。結果以生藥質量濃度為1 g·mL-1的上柱液，通過D-101型大孔吸附樹脂，依次用4 BV水，體積流量為1 BV·h-1，5 BV 65%乙醇，體積流量為2 BV·h-1洗脫，并收集65%乙醇洗脫流分，減壓干燥，分離轉移率平均分別為84.8%、84.2%。結論該方法穩定可行，能較好地純化穿山龍提取物。

穿山龍提取物；總皂苷；薯蕷皂苷；純化；大孔吸附樹脂

穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino的干燥根莖[1]，是中國傳統名藥，也是“泰山四寶”之一。穿山龍中主要藥效成分包括薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、穗菝葜甾苷及其苷元[2-3]。其中薯蕷皂苷可以合成200多種藥物，為合成副腎皮質激素以及口服或注射用避孕藥的主要原料，同時也是心腦血管系統藥物合成的主要原料[4-5]。經過提取純化的穿山龍提取物所含薯蕷皂苷含量較高，成分穩定，市場需求非常大，可以滿足大生產的需要。本文以總皂苷及薯蕷皂苷為指標成分，對穿山龍提取物的提取純化工藝進行系統研究[6-8]，為穿山龍提取物標準的制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Series高效液相色譜儀(Agilent 1200 四元泵，VWD檢測器)，Agilent Chemstation工作站；TU-1901雙波束紫外可見分光光度計(北京普析)；十萬分之一電子天平(Mettler Toledo XS205)。

1.2 試藥

薯蕷皂苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110717-200501)。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。穿山龍采自泰山，經泰安市食品藥品檢驗檢測中心程艷華主任中藥師鑒定為薯蕷科植物穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino的根莖。

2 方法與結果

2.1 薯蕷皂苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 采用HPLC法，以薯蕷皂苷含量計。采用ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，乙腈-水(55∶45)為流動相，測定波長為203 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

2.1.2 薯蕷皂苷對照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷對照品15.25 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇制成含薯蕷皂苷305 μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3 穿山龍粗提物的制備 稱取穿山龍粉末100 g，用10 BV 60%的乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾殘渣，合并濾液，減壓干燥，制備成穿山龍乙醇粗提取物干膏，干燥保存。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取2.1.3項下穿山龍粗提取物干膏1.00 g，置于200 mL容量瓶中，用65%乙醇溶解并定容至刻度。分別取對照品溶液和供試品溶液進樣。色譜圖見圖1和圖2。

1.薯蕷皂苷 圖1 薯蕷皂苷對照品HPLC圖

1.薯蕷皂苷 圖2 穿山龍供試品HPLC圖

2.2 穿山龍總皂苷的測定

2.2.1 對照品溶液的配制 取薯蕷皂苷對照品13.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得對照品儲備溶液。精密量取對照品儲備液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取2.1.3項下干膏1.00 g，置于200 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。

2.2.3 測定波長的選擇 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各2.0 mL，置具塞試管中，水浴揮干溶劑，精密加入高氯酸10 mL，于60 ℃水浴加熱15 min，冰水終止反應，隨行試劑作為空白溶液。分別在190～500 nm進行光譜掃描，薯蕷皂苷及穿山龍總皂苷的吸收曲線基本一致，且都在206 nm 處有最大吸收峰，空白溶液在該波長下無吸收，故選擇206 nm為檢測波長。紫外掃描圖見圖3和圖4。

圖3 薯蕷皂苷對照品紫外掃描圖

圖4 穿山龍供試品紫外掃描圖

2.2.4 標準曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置具塞試管中，水浴揮干溶劑，精密加入高氯酸10 mL，于60 ℃水浴加熱15 min，冰水終止反應，隨行試劑作為空白溶液，在206 nm波長測定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標，質量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程為Y=0.019 11X-0.045 3，r=0.999 4，線性范圍為5.4～54.0 μg·mL-1。

2.3 樹脂型號的篩選

采用平行試驗，以總皂苷及薯蕷皂苷為指標成分，利用靜態吸附，篩選文獻中常用于分離皂苷類的不同型號的大孔樹脂色譜柱。

2.3.1 比吸附量考察 將經過預處理的4種大孔樹脂D-101、AB-8、HPD-600、HP-20去除表面水后各取5 g分別置于具塞磨口錐形瓶中，各精密加入樣品溶液25 mL，置搖床中，振搖24 h，使樹脂充分吸附，過濾，取續濾液進行含量測定，結果表明D101對于本品比吸附較好，見表1。計算公式：

(1)

式中：m1為吸附前溶液中成分質量(mg)；m2為吸附后溶液中成分質量(mg)；m為樹脂重量(g)

表1 不同大孔樹脂比吸附值考察

2.3.2 解吸率考察 將2.3.1項下樣品置于具塞磨口錐形瓶中，精密加入50%乙醇100 mL，置搖床中，具塞振搖24 h，充分解吸附，過濾，取續濾液進行含量測定，結果表明4種樹脂的解吸率相差不大，綜合比較吸附值與解吸率的結果，D-101樹脂有較好的吸附性及解吸率，作為本品的分離用樹脂較理想。見表2。計算公式：

(2)

式中：m為樹脂吸附的成分質量(mg)；m3為解吸附后溶液中成分質量(mg)

表2 不同大孔樹脂解吸率考察

2.4 上樣藥液濃度對吸附效果的影響

分別稱取10 g樹脂分裝于同一型號樹脂柱中，取1 mL相當于1 g生藥的樣品溶液，加水或濃縮配制成相當于原藥液的0.25，0.5，1，2 BV的4種不同濃度的藥液，依次精密量取5，10，20，40 mL的藥液，上柱(體積小于柱體積的上樣后靜置2 h，體積大于柱體積的以流速為1 BV·h-1循環上樣2 h)，收集過柱液體置100 mL量瓶中，加65%乙醇定容至刻度，搖勻，進行含量測定并按公式(1)計算比吸附量。結果發現當藥液每毫升相當于原藥材量2 g時，濃度過大，色譜柱堵塞，溶液無法流下，需要頻繁處理，因此上樣時藥液合理的濃度為每毫升相當于1 g生藥量，即1 000 g穿山龍藥材濃縮至1 000 mL即可。見表3。

2.5 上樣藥液體積流速的考察

分別稱取10 g樹脂分裝于同一型號樹脂柱中，精密量取樣品溶液10 mL，分別以0.5，1，2，3 BV·h-1的流速吸附上柱，收集過柱后溶液，用65%定容至100 mL，測定含量并按公式(1)計算比吸附量。結果表明隨體積流速的增大，樹脂吸附量呈下降趨勢；0.5，1 BV·h-1吸附量較大且結果相近，考慮到工作效率的問題，選擇1 BV·h-1體積流速。見表4。

表3 上樣藥液濃度對吸附效果的影響考察

表4 上樣藥液體積流速的考察

2.6 徑高比的考察

分別稱取處理過的大孔樹脂適量，置于同樣型號樹脂柱中，使徑高比分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶12，依據樹脂重量精密加入適量樣品溶液，按1 BV·h-1體積流速吸附上樣，收集過柱流出液，測定含量并按公式(1)計算比吸附量。結果表明不同的徑高比對皂苷吸附量有一定的影響，當徑高比在1∶2～1∶8時，吸附逐漸增大，繼續增加徑高比后無變化，因此采用徑高比為1∶8。見表5。

表5 徑高比考察

2.7 洗脫劑的考察

取大孔樹脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，經預處理后，取原藥液8 mL，分別用水、25%乙醇、40%乙醇、65%乙醇、80%乙醇、95%乙醇各80 mL，以1 BV·h-1的體積流度梯度洗脫，前1倍柱體積洗脫液棄去，然后依次收集上述洗脫液，每次20 mL，分別測定總皂苷含量及洗脫液中固形物重量，1～4次為水；5～8次為25%乙醇；9～12次為40%乙醇；13～16次為65%乙醇；17～20次為80%乙醇；21～24次為95%乙醇。測定結果表明穿山龍總皂苷主要集中在25%～65%乙醇洗脫液中，占全部醇洗脫液中穿山龍總皂苷的89.1%，洗脫溶劑體積分數繼續增大時皂苷洗脫變化不大；多數固形物存在于蒸餾水洗脫液中，這表明僅用水洗能夠得到很好的除雜效果，所以洗脫溶劑確定為先用水除去大量水溶性雜質，再用65%乙醇洗脫，并收集65%乙醇洗脫流分。見表6。

表6 洗脫劑的考察

2.8 洗脫劑用量考察

2.8.1 水洗脫用量考察 稱取已處理過的樹脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，取原藥液8 mL，上樣，水洗流速為1 BV·h-1，收集上述洗脫液，1 BV收集1份，分別測定總皂苷含量及洗脫液中固形物量。結果表明水洗至5 BV時，流出液中所含固形物量己經很少了，當水洗體積為4 BV時水溶性雜質基本除去，且皂苷類成分損失不大，故確定水的洗脫用量為4 BV。見表7。

表7 水洗脫用量的考察

2.8.2 65%乙醇洗脫用量考察 稱取已處理過的樹脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，移取原藥液8 mL，上樣，用4 BV水，采用1 BV·h-1沖洗，然后用65%乙醇洗脫，收集洗脫液，1 BV收集1份，分別測定總皂苷和薯蕷皂苷的含量。結果表明65%乙醇洗至6倍柱體積時，流出液中所含總皂苷及薯蕷皂苷的含量己經很少了，即5 BV時已經洗脫充分了，故確定65%乙醇的洗脫用量為5 BV。見表8。

2.9 洗脫流速的考察

稱取已處理過的樹脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，取原藥液8 mL，上樣，用4 BV的水，采用1 BV·h-1沖洗，然后用5 BV的65%乙醇洗脫，采用不同體積流量沖洗，收集洗脫液，各定容至100 mL，分別測定總皂苷和薯蕷皂苷的含量。結果表明，隨洗脫體積流量的增加，洗脫下來的皂苷量逐漸減少，分析是因為流速太快，洗脫液還未與皂苷充分接觸，所以洗脫下來量少。1，2 BV·h-1體積流量洗脫下來皂苷量差不多，為提高工作效率，選擇2 BV·h-1合適。見表9。

表8 65%乙醇洗脫用量的考察

表9 體積流量的考察

2.10 驗證實驗

分別取處理過的大孔吸附樹脂100 g，平行3份，分別吸取穿山龍生藥質量濃度為1 g·mL-1的提取液80 mL，按照上述工藝依法上柱，依次洗脫后，減壓干燥，分別測定提取液和洗脫液中總皂苷與薯蕷皂苷的總含量，并計算洗脫率。結果表明穿山龍提取物經過大孔樹脂純化后有效的降低了固形物的量，提高了總皂苷和薯蕷皂苷的含量，洗脫率平均分別為84.8%、84.2%，RSD分別為0.49%、0.65%，表明該工藝穩定，可行。見表10。

表10 穿山龍提取物純化工藝驗證實驗

3 結果與討論

試驗以穿山龍中總皂苷和薯蕷皂苷為指標，對穿山龍提取物的純化工藝進行研究，達到了較好的純化效果，且工藝穩定可行。通過對大孔吸附樹脂純化穿山龍提取物工藝的研究，確定純化工藝為采用D-101型大孔吸附樹脂進行純化，徑高比為1∶8，上樣藥液生藥質量濃度為1 g·mL-1，用4 BV純化水，體積流量為1 BV·h-1，除去雜質，再用5 BV 65%乙醇，體積流量為2 BV·h-1洗脫。經驗證實驗結果表明，在該工藝下，總皂苷和薯蕷皂苷的分離洗脫率均達到80%以上。

中藥成分復雜，可以通過現代中藥提取純化技術，制備中藥提取物，提高有效成分的純度。本研究根據穿山龍藥材中總皂苷和薯蕷皂苷的理化性質及目前大生產的實際情況，采用D-101型大孔樹脂純化穿山龍提取物，使有效成分富集，且穩定性好，為今后穿山龍提取物的標準化建立和生產應用提供參考。

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StudyonPurificationProcessofExtractsfromDioscoreanipponica

LIUBin，GAOWenxue*，DIAOXingbin

(TaianTestingCenterforFoodandDrugControl，Taian271000，China)

Objective：This study aimed to establish the best purification technique for the extraction process ofDioscoreanipponica.MethodsUse the total saponins and diosgenin comprehensive evalution as index，and to purify the extraction fromD.nipponicaby means of macroporous adsorption resin.ResultsThe results showed that after going through the D101 macroporous adsorption resin，eluting by means of 4BV water(1 BV·h-1)，5BV 65% ethanol(2 BV·h-1)，and collecting the dried 65% elute ethanol，the average separation of transfer rate is 84.8% and 84.2%.ConclusionThe process is proved reliable and stable to purify the astraction fromD.nipponica.

Dioscoreanipponicaextracts；Total saponins；Diosgenin；Purification；Macroporous adsorption resin

泰安市科技發展計劃(20123080)

*

高文學，副主任藥師，研究方向：藥品檢驗；Tel：(0538)8334565

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.012

2013-11-25)