基于統(tǒng)計分析研究東北園參皂苷含量的影響因素△

趙伯友，姜國志，孫勝斌，陳翔宇，馮玉康

(神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430)

基于統(tǒng)計分析研究東北園參皂苷含量的影響因素△

趙伯友，姜國志，孫勝斌*，陳翔宇，馮玉康

(神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430)

目的研究東北園參擴增北移后對質(zhì)量的影響，考察不同產(chǎn)地、年限、采收期等因素對東北園參中皂苷Rg1+Re和Rb1的含量的影響。方法采用HPLC法測定，數(shù)據(jù)分析采用獨立樣本T檢驗和單因素方差分析及多元線性回歸。結(jié)果東北園參中人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量水平均受產(chǎn)地與生長年限和采收期影響，影響從大到小的順序是：產(chǎn)地>生長年限>采收期。生曬過程對人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量水平影響不大。結(jié)論以人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量水平為參考，人參種植北移后，其含量雖然偏低，但仍然可以滿足2010年版《中國藥典》要求；生曬過程對質(zhì)量影響不大，東北園參中吉林質(zhì)地為佳，藥用人參五年生優(yōu)于四年生，7～9月采收期內(nèi)，隨時間推移含量依次升高，9月最高。藥用人參最佳選擇仍應(yīng)為五年生9月采收吉林產(chǎn)的園參。

人參皂苷；統(tǒng)計分析；影響因素

人參為五加科Araliaceae植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，具有大補元氣、補脾益肺、生津止渴、安神益智的功效，其中人參皂苷是其主要活性成分。人參皂苷(ginsenoside)為人參的一類具有特征性活性成分，人參質(zhì)量的優(yōu)劣取決于總皂苷和各單體皂苷含量的多寡及比例[1-3]。園參道地藥材主產(chǎn)于東三省，園參原主產(chǎn)于吉林[4]，近年來，隨藥材需求逐年增加，原吉林園參產(chǎn)量難以滿足用藥需求，因此園參的栽培有“擴增北移現(xiàn)象”，最北已經(jīng)擴至黑龍江小興安嶺黑河遜克一帶，目前，僅遜克縣及周邊地區(qū)種植已經(jīng)達到上萬畝，針對這一現(xiàn)象，本文以人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量作為參考，選取黑龍江遜克和吉林集安南北兩個代表產(chǎn)地的人參進行對比研究，以考察園參種植北移新產(chǎn)地后，對人參質(zhì)量的影響，同時考察生長年限、生曬過程、采挖期對園參的影響。在研究中，不同產(chǎn)地、生長年限、采收期等因素對人參中皂苷及非皂苷類成分的影響也時有報道，但對影響因素未進行深一步的數(shù)據(jù)分析，未充分展示出因素重要性順序。本文為了評價各因素對人參中人參皂苷Rg1+Re、Rb1的含量的影響，基于統(tǒng)計分析方法對各因素的重要性進行了排序。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀(美國沃特斯公司)；UV-2550紫外分光光度(日本島津公司)；電子天平(德國賽多利斯)。

1.2 試劑

乙腈為HPLC級，其余試劑均為AR級；實驗用水為純化水，人參皂苷Rg1、Re及Rb1對照品均購自中國食品藥品鑒定研究院，批號分別為110703-201128，110754-201123，110704-201223。

1.3 藥材

分別自吉林集安和黑龍江遜克兩地采挖后，當?shù)刭徺I。按四年和五年，鮮貨和生曬，不同采挖期進行分類。藥材由河北省藥品檢驗所孫寶惠老師鑒定為五加科Araliaceae植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根。

2 方法

2.1 人參中皂苷Rg1+Re、Rb1的含量測定

按照2010年版《中國藥典》人參項下相應(yīng)方法測定人參皂苷Rg1+Re、Rb1的含量[5]。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1進行梯度洗脫，檢測波長為203 nm。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于6 000。

對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品及人參皂苷Rb1對照品，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的混合溶液，搖勻，即得。

表1 人參皂苷含量測定流動相梯度洗脫條件

供試品溶液的制備 鮮品：將園參剪碎，60 ℃以下減壓干燥4小時后粉碎(過四號篩)，再于105 ℃干燥2小時后，取本品粉末(過四號篩)約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙移入100 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz) 30 min，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

干品：將園參洗凈后于日光下曬干后得生曬參，粉碎(過四號篩)后再于105 ℃干燥2 h后，取本品粉末(過四號篩)約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入100 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz) 30分鐘，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法 分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10～20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2 數(shù)據(jù)處理與分析方法

2.2.1 數(shù)據(jù)處理與分析 均采用SPSS11.5完成，所有分析結(jié)果直接引用軟件生成的表格設(shè)定。

2.2.2實驗結(jié)果數(shù)據(jù) 先對二分類因素人參產(chǎn)地、生長年限、干鮮進行兩個獨立樣本的T檢驗以初步分析此三因素對人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量的影響；再對多分類因素采收期進行單因素方差分析，以分析出不同采收期對人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量的具體變化情況及影響；最后采用線性回歸模型對可能的影響因素進行回歸分析，以評價影響因素的重要性次序并可定量評估:

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地和年限的園參中人參皂苷含量情況，見表2。

表2 不同產(chǎn)地和年限的園參中人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量結(jié)果

注：干鮮中“1”表示生曬干品，“2”表示采挖后鮮品

3.2 以SPSS11.5進行分析

3.2.1 因素分析：獨立樣本T檢驗與單因素方差分析

其中人參干鮮、產(chǎn)地、生長年限三因素均用獨立樣本T檢驗，結(jié)果見表3、表4及表5。

表3 干鮮對人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響

表4 產(chǎn)地對人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響

**顯著性差異在0.01水平

表5 生長年限對人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響

從上面初步分析可以看出，人參采挖后干貨與鮮貨對人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響不顯著，即說明生曬過程對人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量無明顯影響。其中產(chǎn)地對人參皂苷Rg1+Re和Rb1產(chǎn)生極其顯著影響，生長年限則可能產(chǎn)生顯著影響。

采收期采用單因素方差分析進行差異顯著性性分析，由方差齊性檢驗知數(shù)據(jù)方差齊，因此采用LSD法進行分析，結(jié)果見表6。

表6 不同采收期園參中人皂苷Rg1+Re和Rb1多重比較結(jié)果

從上面初步分析也可以看出，采收期7月至8月采收人參皂苷Rg1+Re和Rb1有顯著差異，含量均值分別升高0.13%和0.10%(g/g)，但至9月采收時，雖然在均值上有很小升高，但較8月無明顯差異。因此，采收期可能對人參皂苷Rg1+Re和Rb1產(chǎn)生顯著影響。

根據(jù)上述初步分析，可以估計人參的干鮮對人參皂苷Rg1+Re和Rb1的影響不顯著，產(chǎn)地、生長年限、采收期可能顯著影響人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量。下面進一步對該三因素重要性進行分析。

3.2.2 因素重要性分析：回歸分析

以上述人參產(chǎn)地、生長年限、采收期三個因素進行分析，因現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)中，人參產(chǎn)地為二分類變量、生長年限、采收期為有序分類變量，符合多元線性回歸條件，因此，采用多元線性回歸分析該三因素分別對人參皂苷Rg1+Re和Rb1影響的重要性。結(jié)果如下：

3.2.2.1 對人參皂苷Rg1+Re的影響 采用BACKWARD方法進行回歸分析，結(jié)表見表7、表8及表9。

表7 人參皂苷Rg1+Re影響因素線性回歸模型概述

a模型1預測的R值

表8 人參皂苷Rg1+Re影響因素線性回歸模型方差分析b

b因變量是人參皂苷Rg1+Re

表9 人參皂苷Rg1+Re影響因素線性回歸模型系數(shù)b分析

b因變量是人參皂苷Rg1+Re

分析過程建立了一個模型，方差分析有顯著意義，但模型回歸采收期系數(shù)不顯著(0.052接近顯著水平0.05，因此納入回歸方程)，從該模型標準化系數(shù)Beta值可以看出，從主到次影響人參皂苷Rg1+Re含量的順序是產(chǎn)地>年限>采收期。最終回歸方程為：人參皂苷Rg1+Re含量=-0.147×產(chǎn)地+0.083×年限+0.038×采收期-0.017。該回歸方程的意義在于，產(chǎn)地1(吉林集安)較產(chǎn)地2(黑龍江遜克)高，五年生人參較四年生人參高，7～9月人參皂苷Rg1+Re含量依次升高，且產(chǎn)地對人參中Rg1+Re含量的影響較年限大。

3.2.2.2 對人參皂苷Rb1的影響 采用BACKWARD方法進行回歸分析，結(jié)果見表10、表11及表12。

表10 人參皂苷Rb1影響因素線性回歸模型概述

c模型2預測的R值

表11 人參皂苷Rb1影響因素線性回歸模型方差d

d因變量是人參皂苷Rb1

表12 人參皂苷Rb1影響因素線性回歸模型系數(shù)d分析

d因變量是人參皂苷Rb1

分析過程建立了一個模型，方差分析有顯著意義，從該模型標準化系數(shù)Beta值可以看出，從主到次影響人參Rb1含量的順序是產(chǎn)地>年限>采收期。最終回歸方程為：人參皂苷Rb1含量=-0.093×產(chǎn)地+0.081×年限+0.038×采收期-0.193。該回歸方程的意義在于：產(chǎn)地1(吉林集安)較產(chǎn)地2(黑龍江遜克)高，五年生人參較四年生人參高，7～9月人參Rb1含量依次升高，且產(chǎn)地對人參中Rb1含量的影響較年限大。

4 討論

本文選取黑龍江和吉林兩個產(chǎn)地以園參主產(chǎn)地為要求，以考察園參“擴增北移”現(xiàn)象對人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量的影響；由于人參加工過程可能對質(zhì)量產(chǎn)生影響[6]，因此生鮮因素選擇主要考慮生曬加工過程對含量的影響；以人參的傳統(tǒng)采收期為依據(jù)，因此選取7～9月采收的人參并考慮采收期內(nèi)人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量的變化情況；制藥用園參的生長年限一般為4～5年[7]，因此選擇這兩年做為研究對象。

園參種植擴增北移后，兩個產(chǎn)地不同采收期和年限的人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量雖均可符合2010年版《中國藥典》要求，但最佳選擇仍為原主產(chǎn)地吉林，這對高質(zhì)量控制水平如中藥注射劑原料控制具有重要意義，只有對產(chǎn)地、采收期、生長年限等明顯影響以人參皂苷為代表的人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量的因素得到有效控制，才能在源頭上控制注射劑質(zhì)量，才能充分保證注射劑質(zhì)量的均一性。采用統(tǒng)計分析方法可進一步科學的分析出各影響因素的重要性，有利于進一步探索數(shù)據(jù)，全面控制藥材質(zhì)量。

雖然人參皂苷影響因素線性回歸方程常數(shù)項不顯著，但回歸因素通過了檢驗，仍可認為回歸方程有意義。從實驗數(shù)據(jù)和分析得知，各影響因素里人參中人參皂苷Rg1+Re和Rb1的含量水平受產(chǎn)地與生長年限影響較大，其中人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量水平受產(chǎn)地影響最大[8]，生長年限次之，采收期再次之。這與人參在5年內(nèi)隨著生長年限增長人參皂苷Rg1含量有所增加，以人參皂苷Rg1+Re和Rg1+Re+Rb1含量增長趨勢更為明顯的結(jié)果相符[9-11]。鮮品與干品對Rg1+Re和Rb1含量水平無明顯差異，這說明生曬加工過程對人參皂苷Rg1+Re和Rb1含量影響不大。

另外，多元線性回歸僅是對因變量與考察因素間的簡單線性模擬，因此，回歸方程用于預測時需充分考慮考察因素是否獨立且與因變量是否為簡單的線性關(guān)系，同時需要考慮擬合的整體效果與實際的解釋意義。對于因素重要性研究，多元線性回歸中標準化系數(shù)絕對大小可以清晰地說明重要性順序。

本實驗僅從Rg1+Re和Rb1含量水平考察了對人參的影響程度，其它如浸出物、揮發(fā)油、灰分、指紋圖譜等同樣影響人參質(zhì)量的檢查項仍需進一步研究。該方法僅為藥材質(zhì)量分析考察提供了一種思路。

[1] 曲正義，趙景輝，張瑞，等.吉林省不同產(chǎn)地人參總皂苷含量的比較[J].特產(chǎn)研究，2012，(1)：34-36.

[2] 張雅玉.人參皂苷分析方法的研究進展[J].特產(chǎn)研究，1998，(1)：50-52.

[3] 楊繼祥，田義新.藥用植物栽培學[M].農(nóng)業(yè)出版社：2004，2.119.

[4] 黎陽，張鐵軍，劉素香，等.人參化學成分和藥理研究進展[J].中草藥，2009，40(1)：164-166.

[5] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社.2010：附錄8.

[6] 楊朝丹，吉林省人參加工業(yè)發(fā)展研究[J].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2007.

[7] 肖新月，尹繼飛，張南平，等.不同生長年限的人參中8種主要皂苷成分的分析研究[J].藥物分析雜志，2004，24(3)：238-244.

[8] 章觀德.人參的分析Ⅱ[J].藥理學報，1980，13(3)：175-181

[9] 吳雪松，葉正良，郭巧生，等.東北不同產(chǎn)地人參及其加工品外觀性狀及非皂苷類成分比較分析[J].中國中藥雜志.2012.37(16)：2383-2387.

[10] Soldat E，Tanaka O.Panax ginseng:relation between age of plant and content of gensenosides[J].Planta Medica，1984，51(4)：351-352.

[11] 王啟祥.人參皂苷含量變化研究概況[J].西北藥學雜志，2002，10(17)；233-235

TheGinsenosideContentinNortheastGinsengBasedonTheStatisticalAnalysisofInfluencingFactors

ZHAO Boyou，JIANG Guozhi，SUN Shengbin*，CHEN Xiangyu，F(xiàn)ENG Yukang

(ShinewayPharmaceuticalCo.，Ltd.，Shijiazhuang051430，China)

Objective：To study the effect of Northeast ginseng amplification northwards on quality，effect on ginsenoside Rg1+Re and ginsenoside Rb1content in northeast ginseng from different origin，age and harvest time.MethodsThe content was determined by HPLC，and the data was analyzed by independent samples T-test，single-factor analysis of variance and multiple linear regressions.ResultsThe origin，age and havest time effected ginsenoside Rg1+Re and ginsenoside Rb1contend in northeast ginseng，the impact on decreasing order was:the origin>growth age>harvest time.The effect on the ginsenoside Rg1+Re and ginsenoside Rb1content from fresh and dried sample was unremakeble.ConclusionWith ginsenoside Rg1+Re and Rb1level as reference，Ginseng planting northwards，although its content is low，but still can meet the requirements of Pharmacopoeia 2010 edition，raw drying process on the quality have no significant differences，the Northeast ginseng in Jilin texture is good，5 years old than 4 years old，7-9 month recovery period，with the passage of time in September the highest increase in turn.the best choice of ginseng should be harvested in September Jilin ginseng 5 years.

Ginsenoside; Statistical analysis; Influencing factors

國家重大新藥創(chuàng)制專項項目(2011ZX09201-201)

*

孫勝斌，工程師，研究方向：中藥及制劑研究，Tel：(0311)88030066-6532，E-mail：sunshengbin2003@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.012

*顯著性差異在0.05水平的平均差

2013-06-26)