SFE—CO2法與SD法提取杜仲葉揮發油成分的比較

賈智若+李兵+朱小勇+蔡少芳+胡凌青

摘要：分別采用超臨界CO2流體萃取法（SFE-CO2法）與水蒸氣蒸餾法（SD法）從杜仲（Eucommia ulmoids Oliv.）葉中提取揮發油，并結合氣相色譜-質譜儀（GC-MS）對其進行檢測。從SFE-CO2法提取的杜仲葉揮發油中共鑒定出59種成分，占揮發油總量的82.57%；從SD法提取的杜仲葉揮發油中共鑒定出39種成分，占揮發油總量的84.48%。兩種提取方法得到的揮發油組分及其含量差異較大。SFE-CO2法比SD法能更真實、全面的反映杜仲葉藥材的揮發油成分。

關鍵詞： 杜仲（Eucommia ulmoids Oliv.）；揮發油；超臨界CO2萃取法（SFE-CO2法）；水蒸氣蒸餾法（SD法）；GC-MS

中圖分類號：O657.63 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3625-04

Comparison of Chemical Components in the Volatile Oil from Eucommia ulmoides Oliv. Leaf Extracted by Supercritical CO2 Fluid and Steam Distillation Method

JIA Zhi-ruo，LI Bing，ZHU Xiao-yong，CAI Shao-fang，HU Ling-qing

（Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China）

Abstract： The volatile oil was extracted from Eucommia ulmoides Oliv. leaf by supercritical fluid CO2 extraction （SFE-CO2） and steam distillation（SD） and detected with GC-MS. The results showed that 59 components in the volatile oil form Eucommia ulmoides Oliv. leaf were identified by SFE-CO2 method and 39 components by SD method， accounting for 82.57% and 84.48% of the total volatile oil，respectively. The chemical constituents and their contents of volatile oil extracted by two methods were significantly different. The volatile oil extracted by SFE-CO2 can truly and comprehensively reflect the chemical components in Eucommia ulmoides Oliv. leaf more truly and comprehensirely.

Key words： Eucommia ulmoides Oliv.； volatile oil； supercritical CO2 fluid extraction； steam distillation； GC-MS

收稿日期：2013-09-02

基金項目：廣西衛生廳科技創新項目（Z2013203）

作者簡介：賈智若（1979-），女（滿族），遼寧撫順人，講師，在讀博士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎質量標準化，（電話）0771-3137585

（電子信箱） jzr7929@163.com。

杜仲（Eucommia ulmoids Oliv.）是杜仲科杜仲屬的落葉喬木，始載于《神農本草經》，列為上品，具有補中益氣、強筋骨、抗衰老、降血壓等功效。傳統以皮入藥，但由于杜仲皮生長周期長，僅以皮作為藥源會使資源緊缺?，F代科學研究證實杜仲葉和皮化學成分基本一致，與皮具有同等功效，可以葉代皮入藥[1-5]。隨著人們對杜仲葉有效成分和藥理作用的研究不斷深入，杜仲葉的各種藥用功效逐漸為人們所重視，已成為當今藥用及保健品領域開發的熱點，目前已開發的產品有杜仲膠囊、杜仲平壓片、杜仲壯骨丸、杜仲茶等[4]，杜仲葉將成為21世紀人類保健食品的重要植物資源之一，因此對杜仲葉藥用成分進行分析具有重要意義。

本研究采用超臨界CO2萃取法（SFE-CO2法）與水蒸氣蒸餾法（SD法）兩種方法對四川綿陽產杜仲葉進行揮發油提取，運用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對其化學成分進行定性定量分析，比較二者揮發性成分的差異，以期為更好地開發利用杜仲葉資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品來自四川綿陽，自然曬干，經廣西中醫藥大學藥用植物教研室梁子寧副教授鑒定為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoids Oliv.）的干燥葉。

1.2 儀器

美國HP6890/5973N氣相-質譜聯用儀（美國Agilent公司）；HP-5MS彈性毛細管柱（30.0 m×250 μm×0.25 μm）；超臨界CO2萃取裝置（杭州黎泵業有限公司）；揮發油提取器（自制）；LG16-W高速微量離心機（北京醫用離心機廠）。

1.3 方法

1.3.1 杜仲葉揮發油的提取 1）SFE-CO2法：稱取四川綿陽產干燥杜仲葉100 g粉碎，過篩，置于超臨界CO2流體萃取池中。萃取釜壓力20 MPa，溫度50 ℃；分離釜Ⅰ壓力5.5 MPa ，溫度40 ℃；分離釜Ⅱ壓力6 MPa，溫度35 ℃；萃取時間1 h，CO2流量10 L/h，得到有特殊香味的棕黃色油狀物，產率為3.83%。2）SD法：稱取上述杜仲葉100 g，粉碎，過篩，按固液比1∶6加入600 mL去離子水，浸泡2 h后連接揮發油提取器，加熱回流5 h，收集揮發油，餾出液用乙醚萃取，無水硫酸鈉干燥，回收溶劑得到少許具有特殊香味的棕黃色揮發油。endprint

1.3.2 供試品溶液的制備 取上述SFE-CO2法萃取樣品和SD法萃取樣品各適量，分別加乙醚溶解并稀釋，經無水硫酸鈉干燥后得棕黃色溶液，待測。

1.3.3 色譜-質譜條件 HP-5MS毛細管柱（30.0 m×250 μm×0.5 μm）；程序升溫，初始溫度70 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至140 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至溫度250 ℃，保持3 min；進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣，流量為1.0 mL/min；進樣量為1.0 μL；分流比為10∶1。

質譜接口溫度為280 ℃；EI電離方式，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；倍增電壓 1 247 V；掃描范圍45～550 amu；掃描間歇2.94 次/s；溶劑延時3 min。

1.3.4 杜仲葉揮發油樣品的化學成分分析 按上述GC-MS條件對兩種杜仲葉揮發油樣品進行分析，得總離子流圖，見圖1和圖2。所得色譜和質譜信息經計算機數據處理系統進行自動檢索，通過與標準質譜圖庫（NIST02，Wiley275）對照和解析，對杜仲葉揮發油成分進行確認，并用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量，化學成分分析結果見表1。

2 結果與分析

用SFE-CO2法和SD法提取得到的杜仲葉揮發油均具有特殊的濃郁香味，前者外觀顏色為棕黃色，后者顏色略深。SFE-CO2法與SD法所得揮發油相比，收率大為提高，可達3.83%。

兩種方法提取得到的杜仲葉揮發油樣品主要化學成分差異較大。從SD法提取的杜仲葉揮發油中初步鑒定出39種成分，占揮發油總峰面積的84.48%；其中含量較高成分主要有3-呋喃甲醇乙酸酯、肉桂酸乙酯、β-紫羅酮、α-紫羅酮、香葉基丙酮、金合歡烷、2，4-二叔丁基-4-甲基苯酚、棕櫚酸、法尼基丙酮、植酮、棕櫚酸甲酯、植醇等。從SFE-CO2法所得揮發油樣品中初步鑒定出59種成分，占揮發油總峰面積的82.57%，其中含量較高的成分主要有右旋龍腦、肉桂酸乙酯、欖香烯、異丁子香烯、石竹烯、δ-杜松烯、對甲氧基肉桂酸乙酯、牻牛兒酮、棕櫚酸乙酯、植醇、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯、鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯等。兩種揮發油樣品中僅有4-萜烯醇、α-松油醇、二氫獼猴桃內酯、β-二氫大馬酮、左旋乙酸冰片酯、欖香烯、棕櫚酸甲酯、葉綠醇等19種成分相同，但各成分的含量有差異。而SFE-CO2法所得揮發油中含量較高的右旋龍腦、異丁子香烯、蛇床烯、（6R，7E，9R）-9-羥基-4，7-巨豆二烯-3-酮、牻牛兒酮、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯等成分，在SD法中并未檢出。

3 小結與討論

近年來對杜仲葉的研究工作不斷深入，但對杜仲葉揮發油化學成分的研究較少，且提取方法均采用傳統的SD法，提取率低[6，7]。杜仲主產于四川、陜西、河南、貴州、云南等省，其中以川杜仲品質最優，為道地藥材[8]。因此本研究首次采用SFE-CO2法與SD法對四川綿陽產杜仲葉進行揮發油提取，并結合GC-MS技術對其化學成分進行對比分析研究，結果顯示兩種提取方法所得的揮發油組分與含量相差較大，SFE-CO2法提取率更高，揮發油組分更為豐富，由該法提取得到的右旋龍腦、異丁子香烯、蛇床烯、牻牛兒酮等萜烯及其含氧衍生物以及棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯等有機酸酯類成分，在SD法中均未檢出。傳統的SD法操作簡單，成本低，但由于提取過程中加熱時間長，提取溫度高，一些低沸點組分容易揮發流失，一些敏感組分也可能分解或變性，此外揮發油中一些含氧萜烯類化合物，因微溶于水而不易提取出來，從而影響揮發油的品質和收率。SFE-CO2法是一種近年來應用較為廣泛的新型萃取分離技術，與傳統方法相比，萃取條件溫和，可避免一些揮發油成分的熱解及揮發[9，10]。SFE-CO2法提取的揮發油比SD法能更真實、全面地反映杜仲葉藥材中的揮發性化學成分。

參考文獻：

[1] 晏 媛，郭 丹. 杜仲葉的化學成分及藥理活性研究進展[J]. 中成藥，2003，25（6）：491-492.

[2] 葉文峰.杜仲葉中化學成分、藥理活性及應用研究進展[J].林產化工通訊，2004，38（5）：40-44.

[3] 艾倫強，李婷婷，何銀生，等.杜仲的應用研究進展[J].亞太傳統醫藥，2010，6（10）：163-165.

[4] 程光麗.杜仲有效成分分析及藥理學研究進展[J].中成藥， 2006，28（5）：723-725.

[5] 龔桂珍，宮本紅，張學俊，等. 杜仲葉和杜仲皮中化學成分的比較[J]. 西南大學學報（自然科學版）， 2010， 32（7）：165-172.

[6] 鞏 江， 倪士峰， 路 峰， 等. 杜仲葉揮發物質氣相色譜-質譜研究[J]. 安徽農業科學， 2010， 38 （17）： 8998-8999.

[7] 黃相中，張潤芝，關小麗，等.云南楚雄杜仲葉揮發油的化學成分分析[J].云南民族大學學報（自然科學版），2011，5（20）：356-359.

[8] 葉 萌， 郭東力， 羅承德. 四川“三木藥材”的產業化探討[J]. 四川林業科技， 2006， 27（3）：88-90.

[9] 廉宜君，李元元，李 敏，等. 超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾法萃取沙棗花揮發油工藝的比較研究[J].中國中醫藥信息雜志， 2010，17（1）：51-53.

[10] 楊 明，余德順，田戈夫，等.超臨界CO2萃取與水蒸氣蒸餾提取姜油的GC-MS分析[J].貴州化工，2011，36（3）：34-47.endprint

1.3.2 供試品溶液的制備 取上述SFE-CO2法萃取樣品和SD法萃取樣品各適量，分別加乙醚溶解并稀釋，經無水硫酸鈉干燥后得棕黃色溶液，待測。

1.3.3 色譜-質譜條件 HP-5MS毛細管柱（30.0 m×250 μm×0.5 μm）；程序升溫，初始溫度70 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至140 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至溫度250 ℃，保持3 min；進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣，流量為1.0 mL/min；進樣量為1.0 μL；分流比為10∶1。

質譜接口溫度為280 ℃；EI電離方式，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；倍增電壓 1 247 V；掃描范圍45～550 amu；掃描間歇2.94 次/s；溶劑延時3 min。

1.3.4 杜仲葉揮發油樣品的化學成分分析 按上述GC-MS條件對兩種杜仲葉揮發油樣品進行分析，得總離子流圖，見圖1和圖2。所得色譜和質譜信息經計算機數據處理系統進行自動檢索，通過與標準質譜圖庫（NIST02，Wiley275）對照和解析，對杜仲葉揮發油成分進行確認，并用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量，化學成分分析結果見表1。

2 結果與分析

用SFE-CO2法和SD法提取得到的杜仲葉揮發油均具有特殊的濃郁香味，前者外觀顏色為棕黃色，后者顏色略深。SFE-CO2法與SD法所得揮發油相比，收率大為提高，可達3.83%。

兩種方法提取得到的杜仲葉揮發油樣品主要化學成分差異較大。從SD法提取的杜仲葉揮發油中初步鑒定出39種成分，占揮發油總峰面積的84.48%；其中含量較高成分主要有3-呋喃甲醇乙酸酯、肉桂酸乙酯、β-紫羅酮、α-紫羅酮、香葉基丙酮、金合歡烷、2，4-二叔丁基-4-甲基苯酚、棕櫚酸、法尼基丙酮、植酮、棕櫚酸甲酯、植醇等。從SFE-CO2法所得揮發油樣品中初步鑒定出59種成分，占揮發油總峰面積的82.57%，其中含量較高的成分主要有右旋龍腦、肉桂酸乙酯、欖香烯、異丁子香烯、石竹烯、δ-杜松烯、對甲氧基肉桂酸乙酯、牻牛兒酮、棕櫚酸乙酯、植醇、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯、鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯等。兩種揮發油樣品中僅有4-萜烯醇、α-松油醇、二氫獼猴桃內酯、β-二氫大馬酮、左旋乙酸冰片酯、欖香烯、棕櫚酸甲酯、葉綠醇等19種成分相同，但各成分的含量有差異。而SFE-CO2法所得揮發油中含量較高的右旋龍腦、異丁子香烯、蛇床烯、（6R，7E，9R）-9-羥基-4，7-巨豆二烯-3-酮、牻牛兒酮、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯等成分，在SD法中并未檢出。

3 小結與討論

近年來對杜仲葉的研究工作不斷深入，但對杜仲葉揮發油化學成分的研究較少，且提取方法均采用傳統的SD法，提取率低[6，7]。杜仲主產于四川、陜西、河南、貴州、云南等省，其中以川杜仲品質最優，為道地藥材[8]。因此本研究首次采用SFE-CO2法與SD法對四川綿陽產杜仲葉進行揮發油提取，并結合GC-MS技術對其化學成分進行對比分析研究，結果顯示兩種提取方法所得的揮發油組分與含量相差較大，SFE-CO2法提取率更高，揮發油組分更為豐富，由該法提取得到的右旋龍腦、異丁子香烯、蛇床烯、牻牛兒酮等萜烯及其含氧衍生物以及棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯等有機酸酯類成分，在SD法中均未檢出。傳統的SD法操作簡單，成本低，但由于提取過程中加熱時間長，提取溫度高，一些低沸點組分容易揮發流失，一些敏感組分也可能分解或變性，此外揮發油中一些含氧萜烯類化合物，因微溶于水而不易提取出來，從而影響揮發油的品質和收率。SFE-CO2法是一種近年來應用較為廣泛的新型萃取分離技術，與傳統方法相比，萃取條件溫和，可避免一些揮發油成分的熱解及揮發[9，10]。SFE-CO2法提取的揮發油比SD法能更真實、全面地反映杜仲葉藥材中的揮發性化學成分。

參考文獻：

[1] 晏 媛，郭 丹. 杜仲葉的化學成分及藥理活性研究進展[J]. 中成藥，2003，25（6）：491-492.

[2] 葉文峰.杜仲葉中化學成分、藥理活性及應用研究進展[J].林產化工通訊，2004，38（5）：40-44.

[3] 艾倫強，李婷婷，何銀生，等.杜仲的應用研究進展[J].亞太傳統醫藥，2010，6（10）：163-165.

[4] 程光麗.杜仲有效成分分析及藥理學研究進展[J].中成藥， 2006，28（5）：723-725.

[5] 龔桂珍，宮本紅，張學俊，等. 杜仲葉和杜仲皮中化學成分的比較[J]. 西南大學學報（自然科學版）， 2010， 32（7）：165-172.

[6] 鞏 江， 倪士峰， 路 峰， 等. 杜仲葉揮發物質氣相色譜-質譜研究[J]. 安徽農業科學， 2010， 38 （17）： 8998-8999.

[7] 黃相中，張潤芝，關小麗，等.云南楚雄杜仲葉揮發油的化學成分分析[J].云南民族大學學報（自然科學版），2011，5（20）：356-359.

[8] 葉 萌， 郭東力， 羅承德. 四川“三木藥材”的產業化探討[J]. 四川林業科技， 2006， 27（3）：88-90.

[9] 廉宜君，李元元，李 敏，等. 超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾法萃取沙棗花揮發油工藝的比較研究[J].中國中醫藥信息雜志， 2010，17（1）：51-53.

[10] 楊 明，余德順，田戈夫，等.超臨界CO2萃取與水蒸氣蒸餾提取姜油的GC-MS分析[J].貴州化工，2011，36（3）：34-47.endprint

1.3.2 供試品溶液的制備 取上述SFE-CO2法萃取樣品和SD法萃取樣品各適量，分別加乙醚溶解并稀釋，經無水硫酸鈉干燥后得棕黃色溶液，待測。

1.3.3 色譜-質譜條件 HP-5MS毛細管柱（30.0 m×250 μm×0.5 μm）；程序升溫，初始溫度70 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至140 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至溫度250 ℃，保持3 min；進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣，流量為1.0 mL/min；進樣量為1.0 μL；分流比為10∶1。

質譜接口溫度為280 ℃；EI電離方式，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；倍增電壓 1 247 V；掃描范圍45～550 amu；掃描間歇2.94 次/s；溶劑延時3 min。

1.3.4 杜仲葉揮發油樣品的化學成分分析 按上述GC-MS條件對兩種杜仲葉揮發油樣品進行分析，得總離子流圖，見圖1和圖2。所得色譜和質譜信息經計算機數據處理系統進行自動檢索，通過與標準質譜圖庫（NIST02，Wiley275）對照和解析，對杜仲葉揮發油成分進行確認，并用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量，化學成分分析結果見表1。

2 結果與分析

用SFE-CO2法和SD法提取得到的杜仲葉揮發油均具有特殊的濃郁香味，前者外觀顏色為棕黃色，后者顏色略深。SFE-CO2法與SD法所得揮發油相比，收率大為提高，可達3.83%。

兩種方法提取得到的杜仲葉揮發油樣品主要化學成分差異較大。從SD法提取的杜仲葉揮發油中初步鑒定出39種成分，占揮發油總峰面積的84.48%；其中含量較高成分主要有3-呋喃甲醇乙酸酯、肉桂酸乙酯、β-紫羅酮、α-紫羅酮、香葉基丙酮、金合歡烷、2，4-二叔丁基-4-甲基苯酚、棕櫚酸、法尼基丙酮、植酮、棕櫚酸甲酯、植醇等。從SFE-CO2法所得揮發油樣品中初步鑒定出59種成分，占揮發油總峰面積的82.57%，其中含量較高的成分主要有右旋龍腦、肉桂酸乙酯、欖香烯、異丁子香烯、石竹烯、δ-杜松烯、對甲氧基肉桂酸乙酯、牻牛兒酮、棕櫚酸乙酯、植醇、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯、鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯等。兩種揮發油樣品中僅有4-萜烯醇、α-松油醇、二氫獼猴桃內酯、β-二氫大馬酮、左旋乙酸冰片酯、欖香烯、棕櫚酸甲酯、葉綠醇等19種成分相同，但各成分的含量有差異。而SFE-CO2法所得揮發油中含量較高的右旋龍腦、異丁子香烯、蛇床烯、（6R，7E，9R）-9-羥基-4，7-巨豆二烯-3-酮、牻牛兒酮、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯等成分，在SD法中并未檢出。

3 小結與討論

近年來對杜仲葉的研究工作不斷深入，但對杜仲葉揮發油化學成分的研究較少，且提取方法均采用傳統的SD法，提取率低[6，7]。杜仲主產于四川、陜西、河南、貴州、云南等省，其中以川杜仲品質最優，為道地藥材[8]。因此本研究首次采用SFE-CO2法與SD法對四川綿陽產杜仲葉進行揮發油提取，并結合GC-MS技術對其化學成分進行對比分析研究，結果顯示兩種提取方法所得的揮發油組分與含量相差較大，SFE-CO2法提取率更高，揮發油組分更為豐富，由該法提取得到的右旋龍腦、異丁子香烯、蛇床烯、牻牛兒酮等萜烯及其含氧衍生物以及棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯等有機酸酯類成分，在SD法中均未檢出。傳統的SD法操作簡單，成本低，但由于提取過程中加熱時間長，提取溫度高，一些低沸點組分容易揮發流失，一些敏感組分也可能分解或變性，此外揮發油中一些含氧萜烯類化合物，因微溶于水而不易提取出來，從而影響揮發油的品質和收率。SFE-CO2法是一種近年來應用較為廣泛的新型萃取分離技術，與傳統方法相比，萃取條件溫和，可避免一些揮發油成分的熱解及揮發[9，10]。SFE-CO2法提取的揮發油比SD法能更真實、全面地反映杜仲葉藥材中的揮發性化學成分。

參考文獻：

[1] 晏 媛，郭 丹. 杜仲葉的化學成分及藥理活性研究進展[J]. 中成藥，2003，25（6）：491-492.

[2] 葉文峰.杜仲葉中化學成分、藥理活性及應用研究進展[J].林產化工通訊，2004，38（5）：40-44.

[3] 艾倫強，李婷婷，何銀生，等.杜仲的應用研究進展[J].亞太傳統醫藥，2010，6（10）：163-165.

[4] 程光麗.杜仲有效成分分析及藥理學研究進展[J].中成藥， 2006，28（5）：723-725.

[5] 龔桂珍，宮本紅，張學俊，等. 杜仲葉和杜仲皮中化學成分的比較[J]. 西南大學學報（自然科學版）， 2010， 32（7）：165-172.

[6] 鞏 江， 倪士峰， 路 峰， 等. 杜仲葉揮發物質氣相色譜-質譜研究[J]. 安徽農業科學， 2010， 38 （17）： 8998-8999.

[7] 黃相中，張潤芝，關小麗，等.云南楚雄杜仲葉揮發油的化學成分分析[J].云南民族大學學報（自然科學版），2011，5（20）：356-359.

[8] 葉 萌， 郭東力， 羅承德. 四川“三木藥材”的產業化探討[J]. 四川林業科技， 2006， 27（3）：88-90.

[9] 廉宜君，李元元，李 敏，等. 超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾法萃取沙棗花揮發油工藝的比較研究[J].中國中醫藥信息雜志， 2010，17（1）：51-53.

[10] 楊 明，余德順，田戈夫，等.超臨界CO2萃取與水蒸氣蒸餾提取姜油的GC-MS分析[J].貴州化工，2011，36（3）：34-47.endprint