解淀粉芽孢桿菌T1增殖培養基配方及培養條件優化

于靚+程德勇+熊儒先+繆禮鴻

摘要：以解淀粉芽孢桿菌T1為研究菌種，從5種培養基中選出最有利于其生長的基礎發酵培養基，并通過單因子試驗和正交試驗，對基礎發酵培養基的配方及發酵條件進行了優化。結果表明，解淀粉芽孢桿菌T1的最優培養基配方為復合氨基酸營養液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最優培養條件為pH 7.0，裝瓶量80 mL/250 mL、接種量5%、溫度37 ℃、搖床轉速180 r/min、 發酵時間36 h。優化后的培養液中解淀粉芽孢桿菌T1活菌數由1.4×109 cfu/mL增加至3.5×109 cfu/mL。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；培養基；優化；活菌數

中圖分類號： S188 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3621-04

Optimizing the Medium and Culture Conditions for the Multiplication of Bacillus amyloliquefaciens T1 Strain

YU Jing，CHENG De-yong，XIONG Ru-xian，MIAO Li-hong

（Shool of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

Abstract： Using Bacillus amyloliquefaciens T1 as strain， five well-defined culture media were selected to promote its multiplication. The proportion of each component and the culture condtions were optimized with single factor test and orthogonal test. The results showed that a maximal yield of cell amount could be obtained in the medium containing 1% compound amino acid nutrient solution，1.5% peptone，5% molasses and 2.5% soluble starch. The best cultivation conditions were pH 7.0， bottling volume 80 mL/250 mL， inoculum size of 5%， temperature 37 ℃， shaking speed 180 r/min， culture time 36 h. Compared with the initial conditions， the optimized medium and culture conditions resulted in a remarkable increase of the strain multiplication. The maximum yield of the bacteria cells was improved from 1.4×109 cfu/mL to 3.5×109 cfu/mL.

Key word： Bacillus amyloliquefaciens；medium；optimization；viable count

收稿日期：2014-03-18

基金項目：國家“863”計劃項目（2013AA102805-04）

作者簡介：于 靚（1985-），女，湖北武漢人，碩士，研究方向為環境微生物，（電話）13476056651（電子信箱）jing_yu21@163.com；通訊作者，繆禮

鴻（1965-），男，安徽巢縣人，教授，博士，主要從事環境微生物方面的研究，（電話）13971661012（電子信箱）miaowhpu@126.com。

解淀粉芽孢桿菌是廣泛存在于自然界的一種非致病性細菌，該菌與枯草芽孢桿菌親緣性很高，次生代謝產物產生能力較強，能夠分泌抗生素、抗菌蛋白、多肽類物質，從而對多種病原菌、真菌等具有良好的抑制作用[1-4]。如權春善等[5]從堆肥中分離到一株對植物病原菌尖孢鐮刀菌具有強抗菌活性的解淀粉芽孢桿菌Q-12；解淀粉芽孢桿菌FZB42對歐文氏菌引起的梨火疫病具有防治效果[6]。研究表明解淀粉芽孢桿菌的抑菌物質為抑菌蛋白[7，8]。

解淀粉芽孢桿菌T1由武漢輕工大學資源與環境微生物研究室分離得到。解淀粉芽孢桿菌T1能夠產生非蛋白質類溶藻活性物質[9]。這使其具有抑制有害藻，促進有益藻生長的功能。因此解淀粉芽孢桿菌T1菌劑可防治微囊藻水華、修復養殖水體生態，還可安全應用于發酵生產、水產、動物飼料中。據曹海鵬等[10]研究，解淀粉芽孢桿菌對養殖水中氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物和pH等理化因子的影響均控制在水產養殖動物的安全濃度范圍內。本研究從5種液體發酵培養基中選擇出最有利于解淀粉芽孢桿菌T1生長的培養基，并通過單因子試驗和正交試驗優化培養基，得出最優培養基配方，為其大規模生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：解淀粉芽孢桿菌T1由武漢輕工大學資源與環境微生物研究室分離獲得。

復合氨基酸營養液：總氮含量6.2%、NaCl含量20%。

1.2 培養基

試驗所用培養基配方如表1所示，培養基pH 均為7.0，121 ℃滅菌20 min備用。

1.3 解淀粉芽孢桿菌T1發酵培養基的選擇endprint

將活化好的解淀粉芽孢桿菌T1接種到牛肉膏液體培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養24 h。將制備好的種子液以5%接種量接種到5種液體發酵培養基中，裝瓶量為100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min搖床培養，分別在24、36、48、60 h采用稀釋平板涂布計數法測定活菌數，即將菌懸液涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上，于37 ℃恒溫培養24 h后測定菌落數。

1.4 單因素試驗

分別測定接種量、培養基pH、培養基裝瓶量、碳源、氮源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響。①接種量。以液體發酵培養基3作為基礎發酵培養基，pH調至7.0，分別以3%、5%、7%、10%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；②培養基pH。以液體發酵培養基3作為基礎發酵培養基，分別調節培養基pH至5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；③培養基裝瓶量。以液體發酵培養基3作為基礎發酵培養基，pH調至7.0，在250 mL錐形瓶中分別裝60、80、100、120 mL液體發酵培養基，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；④碳源。選擇蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4種碳源分別加入到氮源液體發酵培養基中，添加量均為5 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；⑤氮源。選擇牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、尿素和復合氨基酸營養液5種氮源分別加入到碳源液體發酵培養基中，添加量均為3 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液。

以上各試驗接種液在37 ℃、180 r/min搖床培養36 h后，測定發酵培養液中解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數。

1.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇2種碳源（可溶性淀粉、糖蜜）及2種氮源（蛋白胨、復合氨基酸營養液）和3個水平，采用L9（34）正交試驗確定最佳培養基配方，正交試驗因素水平如表2所示。

采用SPSS軟件分析試驗結果。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌T1發酵培養基的選擇結果

將解淀粉芽孢桿菌T1接種到5種液體發酵培養基中，采用稀釋涂布平板法分別測定在24、36、48、60 h時解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數，結果如圖1所示。由圖1可知，解淀粉芽孢桿菌T1在液體發酵培養基3中發酵36 h時活菌數最大，達到1.4×109 cfu/mL。因此，以液體發酵培養基3和發酵36 h作為解淀粉芽孢桿菌T1的基礎培養基和發酵時間進行后續試驗。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 接種量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響接種量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖2所示。由圖2可知，當接種量為5%時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為1.4×109 cfu/mL，達到最高。因此，選擇接種量為5%。

2.2.2 培養基pH對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 培養基pH對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖3所示。由圖3可知，當培養基pH為7.0時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為1.4×109 cfu/mL，達到最高，因此，最適宜解淀粉芽孢桿菌T1生長的pH為7.0。

2.2.3 培養基裝瓶量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 培養基裝瓶量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖4所示。由圖4可知，培養基裝瓶量為80 mL/250 mL時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為2.3×109 cfu/mL，達到最高，所用培養基最優裝瓶量為80 mL/250 mL。

2.2.5 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖5所示。由圖5可知，糖蜜作為發酵培養基碳源時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數最高，為1.4×109 cfu/mL，其次是可溶性淀粉，得到的解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為9.0×108 cfu/mL，故選擇糖蜜和可溶性淀粉2種碳源因素進行正交試驗優化發酵培養基篩選。

2.2.5 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖6所示。由圖6表明，蛋白胨作為發酵培養基氮源時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數最高，為1.6×109 cfu/mL，其次是復合氨基酸營養液作為發酵培養基氮源時解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為1.4×109 cfu/mL，故選擇蛋白胨和復合氨基酸營養液2種氮源因素進行正交試驗優化發酵培養基篩選。

2.3 正交試驗優化結果

正交試驗結果如表3、表4所示。由表3可知，極差R值的大小為C>B>D>A，即對解淀粉芽孢桿菌T1生長的影響由大到小依次為糖蜜、蛋白胨、可溶性淀粉和復合氨基酸營養液。通過直觀分析和方差分析，得到A1B3C3D3的組合為最優方案。

選擇A1B3C3D3、A1B2C2D2、A2B2C3D1的組合進行驗證試驗，同時用LB液體培養基作為參比培養基，發酵36 h測定解淀粉芽孢桿菌T1活菌數，3次重復。結果表明，解淀粉芽孢桿菌T1在A1B3C3D3組合中的活菌數最高，達到3.5×109 cfu/mL，而在LB液體培養基中的活菌數僅為7.2×108 cfu/mL，其活菌數是LB液體培養基活菌數的4.86倍，是未優化的液體發酵培養基3活菌數（1.4×109 cfu/mL）的2.5倍。A1B2C2D2、A2B2C3D1組合下，其活菌數分別為2.58×109、2.63×109 cfu/mL。驗證試驗結果與正交試驗結果相符，故解淀粉芽孢桿菌T1的最佳發酵培養基配方為復合氨基酸營養液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。

3 小結

從5種液體發酵培養基中選擇出培養解淀粉芽孢桿菌T1活菌數最大的基礎發酵培養基，再通過單因素試驗和正交試驗對培養條件和基礎發酵培養基進行優化。結果表明，最優培養基配方為復合氨基酸營養液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最優培養條件為裝瓶量80 mL/250 mL、接種量5%、pH 7.0、溫度37 ℃、180 r/min、發酵時間36 h。優化后的培養液中解淀粉芽孢桿菌T1活菌數可達3.5×109 cfu/mL，為液體發酵培養基3活菌數1.4×109 cfu/mL的2.5倍。

參考文獻：

[1] 車曉曦，李校堃.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）研究進展[J].北京農業，2010（3）：7-10.

[2] 林藝芬，林河通，陳藝暉，等.生防菌解淀粉芽孢桿菌研究進展[J].包裝與食品機械，2013，30（6）：49-52.

[3] 李 超，吳為中，吳偉龍，等.解淀粉芽孢桿菌對魚腥藻的抑制效果分析與機理初探[J].環境科學學報，2011，31（8）：1602-1608.

[4] 陳 成，催堂兵，于平儒.一株抗真菌的解淀粉芽孢桿菌的鑒定及其抗菌性研究[J].現代食品科技，2011，7（1）：36-39.

[5] 權春善，王軍華，徐洪濤，等.一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及發酵條件的初步研究[J].微生物學報，2006，46（1）：7-12.

[6] CHEN X H， SCHOLZ R， BORRISS M， et al. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease [J]. Journal of Biotechnology，2009，140（2）：38-44.

[7] 郝建安，曹志輝，趙鳳梅，等.解淀粉芽孢桿菌NK10.BAhjaWT抑菌作用的研究[J].微生物學通報，2008，35（6）：903-908.

[8] 張寶俊，張家榕，韓巨才，等.內生解淀粉芽孢桿菌LP-5抗菌蛋白的分離純化及特性[J].植物保護學報，2010，37（2）：143-147.

[9] 許 波，于 靚，繆禮鴻，等.一株芽孢桿菌溶藻活性物質的特性研究[J].武漢工業學院學報，2013，32（1）：28-30.

[10] 曹海鵬，衛若鵬，何 珊，等.水產養殖用解淀粉芽孢桿菌微膠囊的安全性評價[J].中國生物工程雜志，2012，32（5）：58-65.endprint

將活化好的解淀粉芽孢桿菌T1接種到牛肉膏液體培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養24 h。將制備好的種子液以5%接種量接種到5種液體發酵培養基中，裝瓶量為100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min搖床培養，分別在24、36、48、60 h采用稀釋平板涂布計數法測定活菌數，即將菌懸液涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上，于37 ℃恒溫培養24 h后測定菌落數。

1.4 單因素試驗

分別測定接種量、培養基pH、培養基裝瓶量、碳源、氮源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響。①接種量。以液體發酵培養基3作為基礎發酵培養基，pH調至7.0，分別以3%、5%、7%、10%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；②培養基pH。以液體發酵培養基3作為基礎發酵培養基，分別調節培養基pH至5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；③培養基裝瓶量。以液體發酵培養基3作為基礎發酵培養基，pH調至7.0，在250 mL錐形瓶中分別裝60、80、100、120 mL液體發酵培養基，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；④碳源。選擇蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4種碳源分別加入到氮源液體發酵培養基中，添加量均為5 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；⑤氮源。選擇牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、尿素和復合氨基酸營養液5種氮源分別加入到碳源液體發酵培養基中，添加量均為3 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液。

以上各試驗接種液在37 ℃、180 r/min搖床培養36 h后，測定發酵培養液中解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數。

1.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇2種碳源（可溶性淀粉、糖蜜）及2種氮源（蛋白胨、復合氨基酸營養液）和3個水平，采用L9（34）正交試驗確定最佳培養基配方，正交試驗因素水平如表2所示。

采用SPSS軟件分析試驗結果。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌T1發酵培養基的選擇結果

將解淀粉芽孢桿菌T1接種到5種液體發酵培養基中，采用稀釋涂布平板法分別測定在24、36、48、60 h時解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數，結果如圖1所示。由圖1可知，解淀粉芽孢桿菌T1在液體發酵培養基3中發酵36 h時活菌數最大，達到1.4×109 cfu/mL。因此，以液體發酵培養基3和發酵36 h作為解淀粉芽孢桿菌T1的基礎培養基和發酵時間進行后續試驗。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 接種量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響接種量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖2所示。由圖2可知，當接種量為5%時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為1.4×109 cfu/mL，達到最高。因此，選擇接種量為5%。

2.2.2 培養基pH對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 培養基pH對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖3所示。由圖3可知，當培養基pH為7.0時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為1.4×109 cfu/mL，達到最高，因此，最適宜解淀粉芽孢桿菌T1生長的pH為7.0。

2.2.3 培養基裝瓶量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 培養基裝瓶量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖4所示。由圖4可知，培養基裝瓶量為80 mL/250 mL時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為2.3×109 cfu/mL，達到最高，所用培養基最優裝瓶量為80 mL/250 mL。

2.2.5 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖5所示。由圖5可知，糖蜜作為發酵培養基碳源時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數最高，為1.4×109 cfu/mL，其次是可溶性淀粉，得到的解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為9.0×108 cfu/mL，故選擇糖蜜和可溶性淀粉2種碳源因素進行正交試驗優化發酵培養基篩選。

2.2.5 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖6所示。由圖6表明，蛋白胨作為發酵培養基氮源時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數最高，為1.6×109 cfu/mL，其次是復合氨基酸營養液作為發酵培養基氮源時解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為1.4×109 cfu/mL，故選擇蛋白胨和復合氨基酸營養液2種氮源因素進行正交試驗優化發酵培養基篩選。

2.3 正交試驗優化結果

正交試驗結果如表3、表4所示。由表3可知，極差R值的大小為C>B>D>A，即對解淀粉芽孢桿菌T1生長的影響由大到小依次為糖蜜、蛋白胨、可溶性淀粉和復合氨基酸營養液。通過直觀分析和方差分析，得到A1B3C3D3的組合為最優方案。

選擇A1B3C3D3、A1B2C2D2、A2B2C3D1的組合進行驗證試驗，同時用LB液體培養基作為參比培養基，發酵36 h測定解淀粉芽孢桿菌T1活菌數，3次重復。結果表明，解淀粉芽孢桿菌T1在A1B3C3D3組合中的活菌數最高，達到3.5×109 cfu/mL，而在LB液體培養基中的活菌數僅為7.2×108 cfu/mL，其活菌數是LB液體培養基活菌數的4.86倍，是未優化的液體發酵培養基3活菌數（1.4×109 cfu/mL）的2.5倍。A1B2C2D2、A2B2C3D1組合下，其活菌數分別為2.58×109、2.63×109 cfu/mL。驗證試驗結果與正交試驗結果相符，故解淀粉芽孢桿菌T1的最佳發酵培養基配方為復合氨基酸營養液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。

3 小結

從5種液體發酵培養基中選擇出培養解淀粉芽孢桿菌T1活菌數最大的基礎發酵培養基，再通過單因素試驗和正交試驗對培養條件和基礎發酵培養基進行優化。結果表明，最優培養基配方為復合氨基酸營養液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最優培養條件為裝瓶量80 mL/250 mL、接種量5%、pH 7.0、溫度37 ℃、180 r/min、發酵時間36 h。優化后的培養液中解淀粉芽孢桿菌T1活菌數可達3.5×109 cfu/mL，為液體發酵培養基3活菌數1.4×109 cfu/mL的2.5倍。

參考文獻：

[1] 車曉曦，李校堃.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）研究進展[J].北京農業，2010（3）：7-10.

[2] 林藝芬，林河通，陳藝暉，等.生防菌解淀粉芽孢桿菌研究進展[J].包裝與食品機械，2013，30（6）：49-52.

[3] 李 超，吳為中，吳偉龍，等.解淀粉芽孢桿菌對魚腥藻的抑制效果分析與機理初探[J].環境科學學報，2011，31（8）：1602-1608.

[4] 陳 成，催堂兵，于平儒.一株抗真菌的解淀粉芽孢桿菌的鑒定及其抗菌性研究[J].現代食品科技，2011，7（1）：36-39.

[5] 權春善，王軍華，徐洪濤，等.一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及發酵條件的初步研究[J].微生物學報，2006，46（1）：7-12.

[6] CHEN X H， SCHOLZ R， BORRISS M， et al. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease [J]. Journal of Biotechnology，2009，140（2）：38-44.

[7] 郝建安，曹志輝，趙鳳梅，等.解淀粉芽孢桿菌NK10.BAhjaWT抑菌作用的研究[J].微生物學通報，2008，35（6）：903-908.

[8] 張寶俊，張家榕，韓巨才，等.內生解淀粉芽孢桿菌LP-5抗菌蛋白的分離純化及特性[J].植物保護學報，2010，37（2）：143-147.

[9] 許 波，于 靚，繆禮鴻，等.一株芽孢桿菌溶藻活性物質的特性研究[J].武漢工業學院學報，2013，32（1）：28-30.

[10] 曹海鵬，衛若鵬，何 珊，等.水產養殖用解淀粉芽孢桿菌微膠囊的安全性評價[J].中國生物工程雜志，2012，32（5）：58-65.endprint

將活化好的解淀粉芽孢桿菌T1接種到牛肉膏液體培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養24 h。將制備好的種子液以5%接種量接種到5種液體發酵培養基中，裝瓶量為100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min搖床培養，分別在24、36、48、60 h采用稀釋平板涂布計數法測定活菌數，即將菌懸液涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上，于37 ℃恒溫培養24 h后測定菌落數。

1.4 單因素試驗

分別測定接種量、培養基pH、培養基裝瓶量、碳源、氮源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響。①接種量。以液體發酵培養基3作為基礎發酵培養基，pH調至7.0，分別以3%、5%、7%、10%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；②培養基pH。以液體發酵培養基3作為基礎發酵培養基，分別調節培養基pH至5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；③培養基裝瓶量。以液體發酵培養基3作為基礎發酵培養基，pH調至7.0，在250 mL錐形瓶中分別裝60、80、100、120 mL液體發酵培養基，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；④碳源。選擇蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4種碳源分別加入到氮源液體發酵培養基中，添加量均為5 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液；⑤氮源。選擇牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、尿素和復合氨基酸營養液5種氮源分別加入到碳源液體發酵培養基中，添加量均為3 g，以5%接種量接種解淀粉芽孢桿菌T1種子液。

以上各試驗接種液在37 ℃、180 r/min搖床培養36 h后，測定發酵培養液中解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數。

1.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇2種碳源（可溶性淀粉、糖蜜）及2種氮源（蛋白胨、復合氨基酸營養液）和3個水平，采用L9（34）正交試驗確定最佳培養基配方，正交試驗因素水平如表2所示。

采用SPSS軟件分析試驗結果。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌T1發酵培養基的選擇結果

將解淀粉芽孢桿菌T1接種到5種液體發酵培養基中，采用稀釋涂布平板法分別測定在24、36、48、60 h時解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數，結果如圖1所示。由圖1可知，解淀粉芽孢桿菌T1在液體發酵培養基3中發酵36 h時活菌數最大，達到1.4×109 cfu/mL。因此，以液體發酵培養基3和發酵36 h作為解淀粉芽孢桿菌T1的基礎培養基和發酵時間進行后續試驗。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 接種量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響接種量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖2所示。由圖2可知，當接種量為5%時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為1.4×109 cfu/mL，達到最高。因此，選擇接種量為5%。

2.2.2 培養基pH對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 培養基pH對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖3所示。由圖3可知，當培養基pH為7.0時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為1.4×109 cfu/mL，達到最高，因此，最適宜解淀粉芽孢桿菌T1生長的pH為7.0。

2.2.3 培養基裝瓶量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 培養基裝瓶量對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖4所示。由圖4可知，培養基裝瓶量為80 mL/250 mL時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為2.3×109 cfu/mL，達到最高，所用培養基最優裝瓶量為80 mL/250 mL。

2.2.5 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖5所示。由圖5可知，糖蜜作為發酵培養基碳源時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數最高，為1.4×109 cfu/mL，其次是可溶性淀粉，得到的解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為9.0×108 cfu/mL，故選擇糖蜜和可溶性淀粉2種碳源因素進行正交試驗優化發酵培養基篩選。

2.2.5 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌T1活菌數的影響如圖6所示。由圖6表明，蛋白胨作為發酵培養基氮源時，解淀粉芽孢桿菌T1活菌數最高，為1.6×109 cfu/mL，其次是復合氨基酸營養液作為發酵培養基氮源時解淀粉芽孢桿菌T1活菌數為1.4×109 cfu/mL，故選擇蛋白胨和復合氨基酸營養液2種氮源因素進行正交試驗優化發酵培養基篩選。

2.3 正交試驗優化結果

正交試驗結果如表3、表4所示。由表3可知，極差R值的大小為C>B>D>A，即對解淀粉芽孢桿菌T1生長的影響由大到小依次為糖蜜、蛋白胨、可溶性淀粉和復合氨基酸營養液。通過直觀分析和方差分析，得到A1B3C3D3的組合為最優方案。

選擇A1B3C3D3、A1B2C2D2、A2B2C3D1的組合進行驗證試驗，同時用LB液體培養基作為參比培養基，發酵36 h測定解淀粉芽孢桿菌T1活菌數，3次重復。結果表明，解淀粉芽孢桿菌T1在A1B3C3D3組合中的活菌數最高，達到3.5×109 cfu/mL，而在LB液體培養基中的活菌數僅為7.2×108 cfu/mL，其活菌數是LB液體培養基活菌數的4.86倍，是未優化的液體發酵培養基3活菌數（1.4×109 cfu/mL）的2.5倍。A1B2C2D2、A2B2C3D1組合下，其活菌數分別為2.58×109、2.63×109 cfu/mL。驗證試驗結果與正交試驗結果相符，故解淀粉芽孢桿菌T1的最佳發酵培養基配方為復合氨基酸營養液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。

3 小結

從5種液體發酵培養基中選擇出培養解淀粉芽孢桿菌T1活菌數最大的基礎發酵培養基，再通過單因素試驗和正交試驗對培養條件和基礎發酵培養基進行優化。結果表明，最優培養基配方為復合氨基酸營養液1%、蛋白胨1.5%、糖蜜5%、可溶性淀粉2.5%。最優培養條件為裝瓶量80 mL/250 mL、接種量5%、pH 7.0、溫度37 ℃、180 r/min、發酵時間36 h。優化后的培養液中解淀粉芽孢桿菌T1活菌數可達3.5×109 cfu/mL，為液體發酵培養基3活菌數1.4×109 cfu/mL的2.5倍。

參考文獻：

[1] 車曉曦，李校堃.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）研究進展[J].北京農業，2010（3）：7-10.

[2] 林藝芬，林河通，陳藝暉，等.生防菌解淀粉芽孢桿菌研究進展[J].包裝與食品機械，2013，30（6）：49-52.

[3] 李 超，吳為中，吳偉龍，等.解淀粉芽孢桿菌對魚腥藻的抑制效果分析與機理初探[J].環境科學學報，2011，31（8）：1602-1608.

[4] 陳 成，催堂兵，于平儒.一株抗真菌的解淀粉芽孢桿菌的鑒定及其抗菌性研究[J].現代食品科技，2011，7（1）：36-39.

[5] 權春善，王軍華，徐洪濤，等.一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及發酵條件的初步研究[J].微生物學報，2006，46（1）：7-12.

[6] CHEN X H， SCHOLZ R， BORRISS M， et al. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease [J]. Journal of Biotechnology，2009，140（2）：38-44.

[7] 郝建安，曹志輝，趙鳳梅，等.解淀粉芽孢桿菌NK10.BAhjaWT抑菌作用的研究[J].微生物學通報，2008，35（6）：903-908.

[8] 張寶俊，張家榕，韓巨才，等.內生解淀粉芽孢桿菌LP-5抗菌蛋白的分離純化及特性[J].植物保護學報，2010，37（2）：143-147.

[9] 許 波，于 靚，繆禮鴻，等.一株芽孢桿菌溶藻活性物質的特性研究[J].武漢工業學院學報，2013，32（1）：28-30.

[10] 曹海鵬，衛若鵬，何 珊，等.水產養殖用解淀粉芽孢桿菌微膠囊的安全性評價[J].中國生物工程雜志，2012，32（5）：58-65.endprint