苦蕎水提液清除活性氧作用研究

張以忠+鄧琳瓊

摘要：用NBT光化還原法、Fenton反應法和鉬酸銨顯色分光光度法對苦蕎[Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn]葉和莖水提液清除羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（·O2-）和過氧化氫（H2O2）的作用進行了研究。結果表明，苦蕎葉和莖水提液具有較強的清除自由基能力，而且隨水提液濃度增加其清除能力增強。其中葉的清除能力顯著高于莖。

關鍵詞：苦蕎[Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn]；水提液；自由基；清除能力

中圖分類號：R285.5；S517 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3597-04

Scavenging Reactive Oxygen Species by the Aqueous Extraction of

Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn

ZHANG Yi-zhong， DENG Lin-qiong

（School of Geography and Life Science， Bijie University， Bijie 551700， Guizhou，China）

Abstract： The scavenging effects of aqueous extractions from the leaf and the aerial stem of Fagopyrum tartaricum on hydroxyl radicals， superoxide anion radicals and hydrogen peroxide were studied with nitro blue terra-zolium photochemica reduction， Fenton reaction and spectrophotometric assay. The results showed that the aqueous extractions from the leaf and aerial stem of Fagopyrum tartaricum had a strong capacity of scavenging radicals. The scavenging capacity was enhanced with the increase of concentration of the aqueous extractions. The scavenging capacity of the aqueous extractions from leaf was significantly higher than that of those from aerial stem.

Key words： Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn； aqueous extraction； radicals； scavenging capacity

收稿日期：2013-11-14

基金項目：貴州省教育廳自然科學研究項目（黔教科2010074號）；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目（XDJK2012C111）；貴州省科技廳、

畢節市科技局及畢節學院科技聯合基金項目[黔科合J字LKB（2013）21號]

作者簡介：張以忠（1977-），男，貴州畢節人，副教授，碩士，主要從事植物遺傳育種、生物化學及分子生物學研究，（電話）13985887356（電子信箱）

z8300300@126.com。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指生物體內有氧代謝過程中產生或在外界物理化學因素誘導下產生含有氧原子且氧化能力很強的多種物質的總稱[1，2]。主要有超氧陰離子自由基（·O2–）、羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）等。自由基具有高度的化學活性，在生命活動的代謝過程中不斷產生，與生物體衰老及許多疾病的發生都有重要關系[3-7]。正常情況下，活性氧的產生和清除處于平衡狀態，但受到生物或非生物脅迫時，會產生過量的活性氧[8]。高濃度的活性氧可通過脂質過氧化反應等途徑損傷組織細胞，導致細胞死亡、染色體突變和畸變及其機體的癌變[9，10]。因此，抑制脂質過氧化或增強機體抗氧化功能對防御疾病有著重要意義[11]。研究發現，人體長期攝入一定量的抗氧化物質能有效地降低心腦血管疾病和癌癥發病率[12，13]。但一些人工化學合成的抗氧化劑具有一定的毒副作用，因此，從食物中尋找天然的抗氧化劑具有重要意義。

苦蕎[Fagopyrum. tataricum（L.）Gaertn]屬蓼科（Polygnaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）兩個栽培種之一，為一年生草本植物，其營養價值居糧食作物之首。不僅營養成分豐富，營養價值高，而且具有較高的藥用價值，屬藥食兩用作物。具有降糖脂、降膽固醇、消炎等功效，被營養學家們稱為21世紀具有前途的綠色食品[14，15]。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，對保健食品越來越重視，而苦蕎獨特的保健功能倍受人們的關注，但對其抗氧化活性的研究報道較少，且僅集中在某一器官上。而植物的不同器官對活性氧的清除作用有所不同[16]。鑒于此，本研究探討了苦蕎葉和莖水提液對羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（·O2-）和過氧化氫（H2O2）的清除作用，以期為蕎麥遺傳育種、開發及利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為貴州畢節苦蕎（編號：TA2011100800

1），來源于畢節學院地理與生命科學學院蕎麥種子資源庫。endprint

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 苦蕎種子從低溫冰柜中取出，于2012年3月將其播種于貴州省畢節市七星關區鴨池鎮試驗田。盛花期時分別取其莖和葉，蒸餾水洗凈，40 ℃下恒溫烘干至恒重，將其打粉，各取3 g粉末，分別按1∶45（g/mL，下同）和1∶40加蒸餾水，80 ℃下恒溫振蕩（140 r/min）1 h，過濾收集濾液，殘渣分別再按1∶25加蒸餾水，80 ℃恒溫振蕩（140 r/min）1 h，過濾收集濾液，合并兩次濾液即為苦蕎莖和葉水提取液（莖和葉水提液濃度分別為70.0、75.4 mg/mL），將其儲存冰箱備用。

1.2.2 提取液對·OH、·O2-和H2O2的清除率測定

1）提取液對·OH的清除率測定。參照文獻[16]的方法，稍加改動。苦蕎每種器官（莖、葉）均設5個濃度梯度（0.644、1.288、1.932、2.576、3.220 mg/mL），分別測定莖和葉在各濃度下對·OH的清除率。反應體系總體積為3.0 mL，包含pH7.4的PBS 0.75 mL、2 mmol/L的EDTANa2-Fe（Ⅱ）1.0 mL，70 μg/mL的番紅花紅T 0.5 mL，不同濃度供試液0.25 mL和0.33%的H2O2溶液0.5 mL。將其充分混勻，置37 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min后，用723 N型分光光度計于520 nm處測其吸光度。加不同濃度供試液的體系其吸光度為A樣品，以提取介質（蒸餾水）代替供試液的體系其吸光度為A空白，兩者均以未加EDTANa2-Fe（Ⅱ）（用蒸餾水代替）作對照，各自與其對照吸光度之差分別記為△A樣品和△A空白。供試液對·OH的清除能力以清除率表示，清除率=（△A空白-△A樣品）/△A空白×100%。

2）提取液對·O2-的清除率測定。參照文獻[16]的方法，稍加改動。苦蕎每種器官（莖、葉）均設5個濃度梯度（0.256、0.512、0.768、1.024 和1.280 mg/mL），分別測定莖和葉在各濃度下對·O2-的清除率。反應體系總體積為3.25 mL，包含不同濃度提取液0.25 mL，14.5 mmol/L的 L-Met 2.7 mL，3.0 mmol/L的EDTA 0.1 mL，2.25 mmol/L的 NBT 0.1mL，60 μmol/L核黃素0.1 mL（EDTA、NBT、核黃素均以50 mmol/L pH 7.8的PBS配制）。混勻倒入吸光度一致的比色皿，在3 000 lx下光照10 min，反應后立即避光，迅速顛倒混勻，立即在560 nm下測其吸光度。加不同濃度供試液的體系其吸光度為A樣品，以提取介質（蒸餾水）代替供試液的體系其吸光度為A對照，均以PBS代替NBT作空白。樣品管和對照管吸光度與各自空白之差分別記為△A樣品和△A對照。供試液對·O2-的清除能力以清除率表示，清除率=（△A對照-△A樣品）/△A對照×100%。

3）提取液對H2O2的清除率測定。參照文獻[17]的方法，稍加改動。具體方法如下：苦蕎每種器官（莖、葉）均設5個濃度梯度（0.704、1.408、2.112、2.816和3.520 mg/mL），分別測定莖和葉在各濃度下對H2O2的清除率。反應體系總體積為3.25 mL，其反應過程為：在樣品管中加入0.25 mL不同濃度的樣品，然后放入37 ℃水浴鍋，迅速加入1.5 mL基質液[60 mmol/L的PBS（pH 7.4）含65 μmol/L的H2O2]作為樣品組，保溫1.5 min后立即加入32.4 mmol/L鉬酸銨溶液1.5 mL，自來水中終止反應5 min，405 nm處測其吸光度。以提取介質（蒸餾水）代替供試液作對照，均以PBS代替基質液作空白，樣品管和對照管吸光度與各自空白吸光度之差分別記為△A樣品和△A對照。供試液對H2O2的清除能力以清除率表示。清除率=（△A對照-△A樣品）/△A對照×100%。

1.2.3 數據處理 采用Excel 2003計算清除率、繪制折線圖，SPSS11.5統計軟件進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 苦蕎葉和莖水提液對·OH的清除作用

由圖1可知，苦蕎葉和莖水提液對·OH均具有清除作用，且隨水提液濃度的增加，其清除率也不斷升高。在水提液同一濃度下，葉的清除率均高于莖，表明苦蕎葉水提液對·OH的清除作用高于莖。進一步對其作統計分析可知，葉水提液對·OH的平均清除率為76.99%，莖的為45.54%，苦蕎葉水提液對·OH的清除作用顯著（P<0.05）高于莖。

2.2 苦蕎葉和莖水提液對·O2-的清除作用

由圖2可知，苦蕎葉和莖水提液對·O2-均具有清除作用，且隨水提液濃度的增加，其清除率也不斷升高。對其進行統計分析可知，葉水提液對·O2-的平均清除率為79.50%，莖的為57.37%，苦蕎葉水提液對·O2-的清除作用顯著（P<0.05）高于莖。

2.3 苦蕎葉和莖水提液對H2O2的清除作用

由圖3可知，苦蕎葉、莖水提液對H2O2均具有一定的清除作用，但其清除率均較低，供試濃度下的最高清除率均小于50%。另外，其清除率隨濃度的增加變化較小。對其進行統計分析可知，葉水提液對H2O2的平均清除率為16.42%，而莖的只有7.52%，苦蕎葉水提液對H2O2的清除作用顯著（P<0.05）高于莖。

3 小結與討論

活性氧因具有高度的活潑性和極強的氧化能力，對人體危害很大，人體內羥基自由基（·OH） 、超氧陰離子自由基（·O2-）和過氧化氫（H2O2）等活性氧過量會使機體受到損傷，從而引起癌癥、衰老、心血管疾病等[18，19]。正常情況下，機體可以清除一定量的自由基，使體內自由基的產生與清除處于平衡狀態。但當自由基過多，造成機體紊亂時，必須尋找外源性自由基清除劑—抗氧化劑來清除機體內過多的自由基，這是減少癌癥、衰老、心血管疾病等對人類健康威脅的有效手段之一[20]。然而，目前已發現，一些人工化學合成的抗氧化劑可能具有一定的毒副作用，服用此類抗氧化劑更可能會增加傷害機體的可能性。因此，從日常食物中尋找天然的抗氧化劑具有重要意義。endprint

苦蕎屬于自花且是閉花授粉的作物，種植適應性強，生育期短，產量較其他蕎麥種高，含有黃酮、蛋白質、原花青素、膳食纖維等功效分子，尤其是蘆丁的含量遠遠高于甜蕎，具有降糖、抗缺血、抗菌、抗癌、助睡眠等保健功能，屬于藥食兩用植物[15，21，22]，因此越來越受到人們的重視。目前有關苦蕎抗氧化活性的研究報道較少，且均是集中在某一個器官上。姚亞平等[23]研究了苦蕎和甜蕎子粒乙醇提取物的抗氧化性發現，苦蕎和甜蕎乙醇提取物均有顯著的抗氧化性，且呈劑量效應關系。曹艷萍[24]研究了苦蕎葉提取物抗氧化性及其協同效應發現，苦蕎葉提取物對羥自由基和超氧陰離子均有較強的清除能力，隨著苦蕎葉提取物量的增加其抗氧化作用增強。本研究首次對苦蕎盛花期葉和莖水提液清除·OH、·O2-和H2O2進行了研究，結果發現葉和莖水提液對·OH、·O2-和H2O2均有清除作用，且隨提取液濃度的增加其清除率也不斷升高，與姚亞平等[23]及曹艷萍[24]的報道一致。另外，本研究還發現，雖然苦蕎葉和莖水提液對·OH、·O2-和H2O2均有清除作用，但存在一定的差異。葉和莖水提液對·OH和·O2-清除作用均較強，且隨提取液濃度升高其清除作用也不斷增強，但兩者對H2O2的清除作用均較弱，且受濃度影響較小。另外，苦蕎葉水提液對·OH、·O2-和H2O2的清除作用均顯著高于莖。因此本研究可為深入探討苦蕎葉和莖的抗氧化機理和合理開發利用苦蕎資源提供一定參考。而苦蕎在苗期、現蕾期和收獲期葉和莖對·OH、·O2-和H2O2的清除作用是否與本研究結果一致還有待進一步研究。

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苦蕎屬于自花且是閉花授粉的作物，種植適應性強，生育期短，產量較其他蕎麥種高，含有黃酮、蛋白質、原花青素、膳食纖維等功效分子，尤其是蘆丁的含量遠遠高于甜蕎，具有降糖、抗缺血、抗菌、抗癌、助睡眠等保健功能，屬于藥食兩用植物[15，21，22]，因此越來越受到人們的重視。目前有關苦蕎抗氧化活性的研究報道較少，且均是集中在某一個器官上。姚亞平等[23]研究了苦蕎和甜蕎子粒乙醇提取物的抗氧化性發現，苦蕎和甜蕎乙醇提取物均有顯著的抗氧化性，且呈劑量效應關系。曹艷萍[24]研究了苦蕎葉提取物抗氧化性及其協同效應發現，苦蕎葉提取物對羥自由基和超氧陰離子均有較強的清除能力，隨著苦蕎葉提取物量的增加其抗氧化作用增強。本研究首次對苦蕎盛花期葉和莖水提液清除·OH、·O2-和H2O2進行了研究，結果發現葉和莖水提液對·OH、·O2-和H2O2均有清除作用，且隨提取液濃度的增加其清除率也不斷升高，與姚亞平等[23]及曹艷萍[24]的報道一致。另外，本研究還發現，雖然苦蕎葉和莖水提液對·OH、·O2-和H2O2均有清除作用，但存在一定的差異。葉和莖水提液對·OH和·O2-清除作用均較強，且隨提取液濃度升高其清除作用也不斷增強，但兩者對H2O2的清除作用均較弱，且受濃度影響較小。另外，苦蕎葉水提液對·OH、·O2-和H2O2的清除作用均顯著高于莖。因此本研究可為深入探討苦蕎葉和莖的抗氧化機理和合理開發利用苦蕎資源提供一定參考。而苦蕎在苗期、現蕾期和收獲期葉和莖對·OH、·O2-和H2O2的清除作用是否與本研究結果一致還有待進一步研究。

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