巨大芽孢桿菌發酵培養基的優化

饒犇+王亞平+李娜+周榮華+廖先清+劉芳+陳偉+張光陽+楊自文

摘要：為了得到巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）發酵的最佳培養基，在單因子試驗的基礎上，應用Plackett-Burman設計法對影響芽孢產量的基本培養基組分中的關鍵因子進行了篩選，并進一步采用響應面分析法（RSM）對影響芽孢產量的關鍵因素最佳水平作了深入的研究。結果表明，影響巨大芽孢桿菌芽孢產量的關鍵因素是豆粕和淀粉的濃度。通過RSM的擬合和推算得到在豆粕和淀粉濃度分別為48.85和19.67 g/L時，此時模型預測發酵最佳產量為43.16×108 CFU/mL，驗證值為42.2×108 CFU/mL，預測值與驗證值之間吻合較好，比原始培養基提高了約10倍。

關鍵詞：巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；Plackett-Burman設計法；響應面分析法（RSM）

中圖分類號：Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3539-03

Optimizing Fermentation Conditions of Bacillus megaterium

RAO Ben1，WANG Ya-ping2， LI Na3， ZHOU Rong-hua1，LIAO Xian-qing1，LIU Fang1，CHEN Wei1，ZHANG Guang-yang1，YANG Zi-wen1

（1.Biological Pesticide Engineering Research Center，Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China；2.Key Lab of Industrial Biotechnology， Hubei University， Wuhan 430062，China；3. Department of Life Science and technology/Yunan Provincial Key lab of Crop Quality and Efficient Cultivation and Safety Control， Red River Insitute，Mengzi 661100，Yunan，China ）

Abstract： To obtain the optimal medium for producing Bacillus megaterium spore， statistical method was used to investigate the medium components for spore concentration and productivity by Bacillus megaterium. The Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of six variables. The results showed that the optimal values of the two parameters determined by RSM were soya bean meal of 48.85 g/L and starch of 19.67 g/L. The spore production was predicted to be 43.16×108 CFU/mL， and the actual value was 42.2×108 CFU/mL. They were fitted well with 10 folds increase.

Key words： Bacillus megaterium； Plackett-Burman； response surface analysis methodology （RSM）

收稿日期：2013-11-05

基金項目：國家科技支撐計劃項目（2011BAD40B01）；湖北省農業科技創新中心項目（2013NKYJJ21）

作者簡介：饒 犇（1983-），男，湖北孝感人，助理研究員，博士，主要從事發酵工程方面的研究，（電話）15623076968（電子信箱）

623253512@qq.com。

農業生產長期過分依賴化學肥料和農藥，已經造成了農田土質和肥力下降，農作物品質降低，食品和地下水等環境污染也日趨嚴重。隨著生態農業和綠色食品生產的興起和發展，加之我國大多數土壤中速效磷、鉀及其他一些養分的缺乏，微生物肥料作為生物技術發展和農業生產的一類重要肥源引起人們的重視。微生物肥料是指一類含有活微生物的特定制品，將它應用于農業生產中，能夠獲得特定的肥料供應。

磷是植物三大營養元素之一，土壤含磷較多，能被植物直接利用的卻極少，絕大部分是以不溶性的無機磷或植物不能利用的有機磷形式存在。微生物通過產酸或產酶等作用可使這些無效形式的磷化物轉變為植物可利用的養料。土壤中約半數的微生物可分解有機磷，其中應用較多的是巨大芽孢桿菌[1-6]。

巨大芽孢桿菌可以用來生產解磷肥，具有很好的降解土壤中有機磷的功效，是生產生物有機肥的常用菌種，也是制作水體處理劑的常用菌種。為此，探索其培養條件和發酵工藝，可為工業化發酵生產奠定基礎。

本研究以實驗室自行分離得到的巨大芽孢桿菌NRJD20121菌株為研究對象，對其培養基和培養條件進行Plackett-Burman試驗，篩選出顯著的影響因子，然后通過響應面試驗組合設計，擬合出數學模型方程，從而找到最優條件組合，并對其試驗結果進行評估，以期初步篩選出比較合適的培養基配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 由實驗室自行分離，經鑒定為芽孢桿菌屬中的Bacillus megaterium，編號為NRJD20121。

1.1.2 培養基 固體培養基為LB培養基。種子培養基配方（g/L）：淀粉16，酵母抽提物4，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5；pH 7.0。發酵培養基配方（g/L）：淀粉15，豆粕25，KH2PO4 2，Na2HPO4 0.5，CaCO3 0.5，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5。后期采用優化后的配方。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵培養條件 接種體積分數為5%，發酵溫度為30 ℃，搖床轉速為200 r/min，發酵48 h。

1.2.2 Plackett-Burman試驗 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養基成分進行考察，篩選影響生物量和芽孢產量的重要因素，確定最佳配方。以可溶性淀粉為碳源，以豆粕為氮源，設置豆粕濃度為X1、KH2PO4為X2、Na2HPO4為X3、淀粉為X4、CaCO3為X5、MgSO4為X6、MnSO4為X7（表1）。

1.2.3 最陡爬坡試驗 根據Plackett-Burman試驗得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗來確定因素取值中心點。擬合方程中各變量系數確定爬坡方向和變化步長，步長確定和試驗條件相關。

1.2.4 中心組合設計和響應面分析 對Plackett-Burman試驗確定的因素，以最陡爬坡試驗得到的中心點。根據中心組合設計結果來擬合數據，得到描述響應值和自變量之間關系的二階模型，即：

Y=b0+biXj+bijXiXj+biiXi2+e

其中，Y是產物能力測量值，b0是b截距，bi是關鍵因素線性效果的系數，bii是關鍵因素的二次效應的系數，bij是關鍵因素間交互作用的系數，Xi、Xj分別為各因子變量。

根據擬合的數學模型以及方差分析的結果，可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應面圖和等高線圖直觀地描繪其結果，同時利用擬合的數學方程求解最優的結果。

1.2.5 培養基優化結果驗證試驗 用優化后的培養基組分配制發酵培養基，以5%接種量接入裝液量為20 mL的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min條件下培養30 h。發酵結束后測定發酵液中的芽孢量。

1.2.5 生物量和芽孢數測定 活菌數按常規平板計數法測定[7]，檢測芽孢數前，將菌液在80 ℃預處理20 min，再按照常規平板計數法測定[8，9]。

2 結果和討論

2.1 Plackett-Burman試驗各因素參數的t-檢驗分析結果

Plackett-Burman試驗各因素參數的t-檢驗分析結果見表2。由表2可知，淀粉和豆粕對巨大芽孢桿菌的生長和芽孢形成有顯著影響，可信度在95%以上。且兩者對芽孢形成的影響是正效應。

2.2 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗設計與結果見表3。由表3可得如下回歸方程：

Y=30.25+3.583 3X1+0.583 3X2-0.250 0X3+1.083 3X4-0.583 3X5+0.750 0X6-0.583 3X7

該方程擬合的R2=0.967 4，此多項式方程能很好地模擬和解釋Plackett-Burman的試驗結果。

2.3 中心組合設計試驗

根據Plackett-Burman試驗可知，影響巨大芽孢桿菌芽孢產量的兩個重要因素分別是可溶性淀粉和豆粕。根據中心優化組合方法，設計了2因素5水平的響應面分析，試驗設計見表4。由表4可知，開始時巨大芽孢桿菌芽孢產量隨著豆粕與淀粉濃度的升高而增加，在步移進行至第三步時達到最高點，之后巨大芽孢桿菌芽孢產量開始下降。步移最高點時豆粕與淀粉的濃度分別為45 g/L和21 g/L，此點被用作下一步響應面分析的中心點。

以可溶性淀粉和豆粕為自變量，以巨大芽孢桿菌的芽孢數為響應值，根據分析結果得到的二次多項式回歸方程為：

Y=-676.546+9.442 65X1+49.778 7X2-0.079 74X12

-1.163 9X22-0.083 333X1X2

其中，Y為響應值，X1為豆粕濃度，X2為淀粉濃度。

回歸方程各項方差分析表明，方程一次項和二次項X1和X2的P值均小于0.05，說明影響顯著。失擬項P=0.464>0.1，無失擬現象。回歸方程的R2=0.997 4，調整值為0.995 5，說明回歸方程對試驗結果具有較好的擬合能力。

利用Minitab軟件對回歸模型進行響應面分析，考察所擬合響應面的形狀，得到各響應面立體分析圖和相應等高圖，見圖1和圖2。軟件分析可知該模型具有最大值，利用Minitab軟件響應優化器進行計算可得，最大值處X1=48.85 g/L，X2=19.67 g/L，在此條件下理論預測得到的值為43.16×108 CFU/mL。

2.4 最佳培養基的驗證

為了確定試驗結果的可靠性，對上述優化條件進行了驗證試驗，共做了3組平行試驗，結果測得巨大芽孢桿菌的芽孢數為42.2×108 CFU/mL，與預測值十分接近。

3 小結與討論

對巨大芽孢桿菌產芽孢培養基進行了優化研究，得到最佳培養基配方（g/mL）：淀粉19.67、豆粕48.85、KH2PO4 2、Na2HPO4 0.5、CaCO3 0.5、MgSO4 0.5、MnSO4 0.5，在此條件下，巨大芽孢桿菌生成芽孢的理論最高產量為43.16×108 CFU/mL，驗證試驗中最高值為42.2×108 CFU/mL，與理論預測相符，與優化前相比產量提高了10倍。

參考文獻：

[1] 龍 蘇，李法峰，陳 明，等.固氮球形芽孢桿菌與巨大芽孢桿菌的混合增效作用[J].核農學報，2000，14（6）：337-341.

[2] 連 賓.硅酸鹽細菌的解鉀作用研究[M].貴陽：貴州科技出版社，1998.

[3] 鐘傳青，黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學報，2005，42（2）：285-293.

[4] SEN R， SWAMINATHAN T. Application of response surface methodology to evaluate the optimum environmental conditions for the enhanced production of surfactin[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，1997，47（4）：358-363.

[5] SPINOSA M R， BRACCINI T， RICCA E， et al. On the fate of ingested Bacillus spores[J]. Research in Microbiology， 2000，151：361-368.

[6] 徐世榮，陳 驤，吳云鵬. 細菌芽孢形成機制在微生態制劑生產中的應用。食品與生物技術學報，2007，26（4）：121-126.

[7] 周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1986.

[8] 杜連祥.工業微生物學實驗技術[M].天津：天津科學技術出版社，1992.

[9] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，1999.

1.1.2 培養基 固體培養基為LB培養基。種子培養基配方（g/L）：淀粉16，酵母抽提物4，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5；pH 7.0。發酵培養基配方（g/L）：淀粉15，豆粕25，KH2PO4 2，Na2HPO4 0.5，CaCO3 0.5，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5。后期采用優化后的配方。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵培養條件 接種體積分數為5%，發酵溫度為30 ℃，搖床轉速為200 r/min，發酵48 h。

1.2.2 Plackett-Burman試驗 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養基成分進行考察，篩選影響生物量和芽孢產量的重要因素，確定最佳配方。以可溶性淀粉為碳源，以豆粕為氮源，設置豆粕濃度為X1、KH2PO4為X2、Na2HPO4為X3、淀粉為X4、CaCO3為X5、MgSO4為X6、MnSO4為X7（表1）。

1.2.3 最陡爬坡試驗 根據Plackett-Burman試驗得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗來確定因素取值中心點。擬合方程中各變量系數確定爬坡方向和變化步長，步長確定和試驗條件相關。

1.2.4 中心組合設計和響應面分析 對Plackett-Burman試驗確定的因素，以最陡爬坡試驗得到的中心點。根據中心組合設計結果來擬合數據，得到描述響應值和自變量之間關系的二階模型，即：

Y=b0+biXj+bijXiXj+biiXi2+e

其中，Y是產物能力測量值，b0是b截距，bi是關鍵因素線性效果的系數，bii是關鍵因素的二次效應的系數，bij是關鍵因素間交互作用的系數，Xi、Xj分別為各因子變量。

根據擬合的數學模型以及方差分析的結果，可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應面圖和等高線圖直觀地描繪其結果，同時利用擬合的數學方程求解最優的結果。

1.2.5 培養基優化結果驗證試驗 用優化后的培養基組分配制發酵培養基，以5%接種量接入裝液量為20 mL的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min條件下培養30 h。發酵結束后測定發酵液中的芽孢量。

1.2.5 生物量和芽孢數測定 活菌數按常規平板計數法測定[7]，檢測芽孢數前，將菌液在80 ℃預處理20 min，再按照常規平板計數法測定[8，9]。

2 結果和討論

2.1 Plackett-Burman試驗各因素參數的t-檢驗分析結果

Plackett-Burman試驗各因素參數的t-檢驗分析結果見表2。由表2可知，淀粉和豆粕對巨大芽孢桿菌的生長和芽孢形成有顯著影響，可信度在95%以上。且兩者對芽孢形成的影響是正效應。

2.2 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗設計與結果見表3。由表3可得如下回歸方程：

Y=30.25+3.583 3X1+0.583 3X2-0.250 0X3+1.083 3X4-0.583 3X5+0.750 0X6-0.583 3X7

該方程擬合的R2=0.967 4，此多項式方程能很好地模擬和解釋Plackett-Burman的試驗結果。

2.3 中心組合設計試驗

根據Plackett-Burman試驗可知，影響巨大芽孢桿菌芽孢產量的兩個重要因素分別是可溶性淀粉和豆粕。根據中心優化組合方法，設計了2因素5水平的響應面分析，試驗設計見表4。由表4可知，開始時巨大芽孢桿菌芽孢產量隨著豆粕與淀粉濃度的升高而增加，在步移進行至第三步時達到最高點，之后巨大芽孢桿菌芽孢產量開始下降。步移最高點時豆粕與淀粉的濃度分別為45 g/L和21 g/L，此點被用作下一步響應面分析的中心點。

以可溶性淀粉和豆粕為自變量，以巨大芽孢桿菌的芽孢數為響應值，根據分析結果得到的二次多項式回歸方程為：

Y=-676.546+9.442 65X1+49.778 7X2-0.079 74X12

-1.163 9X22-0.083 333X1X2

其中，Y為響應值，X1為豆粕濃度，X2為淀粉濃度。

回歸方程各項方差分析表明，方程一次項和二次項X1和X2的P值均小于0.05，說明影響顯著。失擬項P=0.464>0.1，無失擬現象。回歸方程的R2=0.997 4，調整值為0.995 5，說明回歸方程對試驗結果具有較好的擬合能力。

利用Minitab軟件對回歸模型進行響應面分析，考察所擬合響應面的形狀，得到各響應面立體分析圖和相應等高圖，見圖1和圖2。軟件分析可知該模型具有最大值，利用Minitab軟件響應優化器進行計算可得，最大值處X1=48.85 g/L，X2=19.67 g/L，在此條件下理論預測得到的值為43.16×108 CFU/mL。

2.4 最佳培養基的驗證

為了確定試驗結果的可靠性，對上述優化條件進行了驗證試驗，共做了3組平行試驗，結果測得巨大芽孢桿菌的芽孢數為42.2×108 CFU/mL，與預測值十分接近。

3 小結與討論

對巨大芽孢桿菌產芽孢培養基進行了優化研究，得到最佳培養基配方（g/mL）：淀粉19.67、豆粕48.85、KH2PO4 2、Na2HPO4 0.5、CaCO3 0.5、MgSO4 0.5、MnSO4 0.5，在此條件下，巨大芽孢桿菌生成芽孢的理論最高產量為43.16×108 CFU/mL，驗證試驗中最高值為42.2×108 CFU/mL，與理論預測相符，與優化前相比產量提高了10倍。

參考文獻：

[1] 龍 蘇，李法峰，陳 明，等.固氮球形芽孢桿菌與巨大芽孢桿菌的混合增效作用[J].核農學報，2000，14（6）：337-341.

[2] 連 賓.硅酸鹽細菌的解鉀作用研究[M].貴陽：貴州科技出版社，1998.

[3] 鐘傳青，黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學報，2005，42（2）：285-293.

[4] SEN R， SWAMINATHAN T. Application of response surface methodology to evaluate the optimum environmental conditions for the enhanced production of surfactin[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，1997，47（4）：358-363.

[5] SPINOSA M R， BRACCINI T， RICCA E， et al. On the fate of ingested Bacillus spores[J]. Research in Microbiology， 2000，151：361-368.

[6] 徐世榮，陳 驤，吳云鵬. 細菌芽孢形成機制在微生態制劑生產中的應用。食品與生物技術學報，2007，26（4）：121-126.

[7] 周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1986.

[8] 杜連祥.工業微生物學實驗技術[M].天津：天津科學技術出版社，1992.

[9] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，1999.

1.1.2 培養基 固體培養基為LB培養基。種子培養基配方（g/L）：淀粉16，酵母抽提物4，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5；pH 7.0。發酵培養基配方（g/L）：淀粉15，豆粕25，KH2PO4 2，Na2HPO4 0.5，CaCO3 0.5，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5。后期采用優化后的配方。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵培養條件 接種體積分數為5%，發酵溫度為30 ℃，搖床轉速為200 r/min，發酵48 h。

1.2.2 Plackett-Burman試驗 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養基成分進行考察，篩選影響生物量和芽孢產量的重要因素，確定最佳配方。以可溶性淀粉為碳源，以豆粕為氮源，設置豆粕濃度為X1、KH2PO4為X2、Na2HPO4為X3、淀粉為X4、CaCO3為X5、MgSO4為X6、MnSO4為X7（表1）。

1.2.3 最陡爬坡試驗 根據Plackett-Burman試驗得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗來確定因素取值中心點。擬合方程中各變量系數確定爬坡方向和變化步長，步長確定和試驗條件相關。

1.2.4 中心組合設計和響應面分析 對Plackett-Burman試驗確定的因素，以最陡爬坡試驗得到的中心點。根據中心組合設計結果來擬合數據，得到描述響應值和自變量之間關系的二階模型，即：

Y=b0+biXj+bijXiXj+biiXi2+e

其中，Y是產物能力測量值，b0是b截距，bi是關鍵因素線性效果的系數，bii是關鍵因素的二次效應的系數，bij是關鍵因素間交互作用的系數，Xi、Xj分別為各因子變量。

根據擬合的數學模型以及方差分析的結果，可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應面圖和等高線圖直觀地描繪其結果，同時利用擬合的數學方程求解最優的結果。

1.2.5 培養基優化結果驗證試驗 用優化后的培養基組分配制發酵培養基，以5%接種量接入裝液量為20 mL的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min條件下培養30 h。發酵結束后測定發酵液中的芽孢量。

1.2.5 生物量和芽孢數測定 活菌數按常規平板計數法測定[7]，檢測芽孢數前，將菌液在80 ℃預處理20 min，再按照常規平板計數法測定[8，9]。

2 結果和討論

2.1 Plackett-Burman試驗各因素參數的t-檢驗分析結果

Plackett-Burman試驗各因素參數的t-檢驗分析結果見表2。由表2可知，淀粉和豆粕對巨大芽孢桿菌的生長和芽孢形成有顯著影響，可信度在95%以上。且兩者對芽孢形成的影響是正效應。

2.2 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗設計與結果見表3。由表3可得如下回歸方程：

Y=30.25+3.583 3X1+0.583 3X2-0.250 0X3+1.083 3X4-0.583 3X5+0.750 0X6-0.583 3X7

該方程擬合的R2=0.967 4，此多項式方程能很好地模擬和解釋Plackett-Burman的試驗結果。

2.3 中心組合設計試驗

根據Plackett-Burman試驗可知，影響巨大芽孢桿菌芽孢產量的兩個重要因素分別是可溶性淀粉和豆粕。根據中心優化組合方法，設計了2因素5水平的響應面分析，試驗設計見表4。由表4可知，開始時巨大芽孢桿菌芽孢產量隨著豆粕與淀粉濃度的升高而增加，在步移進行至第三步時達到最高點，之后巨大芽孢桿菌芽孢產量開始下降。步移最高點時豆粕與淀粉的濃度分別為45 g/L和21 g/L，此點被用作下一步響應面分析的中心點。

以可溶性淀粉和豆粕為自變量，以巨大芽孢桿菌的芽孢數為響應值，根據分析結果得到的二次多項式回歸方程為：

Y=-676.546+9.442 65X1+49.778 7X2-0.079 74X12

-1.163 9X22-0.083 333X1X2

其中，Y為響應值，X1為豆粕濃度，X2為淀粉濃度。

回歸方程各項方差分析表明，方程一次項和二次項X1和X2的P值均小于0.05，說明影響顯著。失擬項P=0.464>0.1，無失擬現象。回歸方程的R2=0.997 4，調整值為0.995 5，說明回歸方程對試驗結果具有較好的擬合能力。

利用Minitab軟件對回歸模型進行響應面分析，考察所擬合響應面的形狀，得到各響應面立體分析圖和相應等高圖，見圖1和圖2。軟件分析可知該模型具有最大值，利用Minitab軟件響應優化器進行計算可得，最大值處X1=48.85 g/L，X2=19.67 g/L，在此條件下理論預測得到的值為43.16×108 CFU/mL。

2.4 最佳培養基的驗證

為了確定試驗結果的可靠性，對上述優化條件進行了驗證試驗，共做了3組平行試驗，結果測得巨大芽孢桿菌的芽孢數為42.2×108 CFU/mL，與預測值十分接近。

3 小結與討論

對巨大芽孢桿菌產芽孢培養基進行了優化研究，得到最佳培養基配方（g/mL）：淀粉19.67、豆粕48.85、KH2PO4 2、Na2HPO4 0.5、CaCO3 0.5、MgSO4 0.5、MnSO4 0.5，在此條件下，巨大芽孢桿菌生成芽孢的理論最高產量為43.16×108 CFU/mL，驗證試驗中最高值為42.2×108 CFU/mL，與理論預測相符，與優化前相比產量提高了10倍。

參考文獻：

[1] 龍 蘇，李法峰，陳 明，等.固氮球形芽孢桿菌與巨大芽孢桿菌的混合增效作用[J].核農學報，2000，14（6）：337-341.

[2] 連 賓.硅酸鹽細菌的解鉀作用研究[M].貴陽：貴州科技出版社，1998.

[3] 鐘傳青，黃為一.不同種類解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的變化[J].土壤學報，2005，42（2）：285-293.

[4] SEN R， SWAMINATHAN T. Application of response surface methodology to evaluate the optimum environmental conditions for the enhanced production of surfactin[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，1997，47（4）：358-363.

[5] SPINOSA M R， BRACCINI T， RICCA E， et al. On the fate of ingested Bacillus spores[J]. Research in Microbiology， 2000，151：361-368.

[6] 徐世榮，陳 驤，吳云鵬. 細菌芽孢形成機制在微生態制劑生產中的應用。食品與生物技術學報，2007，26（4）：121-126.

[7] 周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1986.

[8] 杜連祥.工業微生物學實驗技術[M].天津：天津科學技術出版社，1992.

[9] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，1999.