真鯛、黑鯛及其雜交子代的染色體構成與AFLP分析

林勉，苗亮，李明云＊，俞寅寅，徐萬土

（1.寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波315211；2.象山港灣水產苗種有限公司，浙江 象山315702）

1 引言

真鯛Pagrosomusmaj or和黑鯛Spr ausmacrocephalus均是我國重要的海水養殖經濟魚類。真鯛屬鱸形目、鯛科、真鯛屬，具有個體大、生長快、肉質好、色澤美、抗病能力強等特點，但對鹽度、溫度敏感；黑鯛屬鱸形目、鯛科、黑鯛屬，對溫度、鹽度適應范圍較廣，但養成周期長、抗病能力弱［1］。二者各有優缺點，通過雜交育種，有可能獲得具有雙親優良性狀的雜交子代。目前已有鯛科魚類雜交育種的研究報道，如江世貴等［2］進行了平鯛（♀）與真鯛（♂）的雜交；單保黨等［3］對真鯛、黑鯛進行了正、反交，均獲得了雜交子代；蔣宏雷等［4］、姜景騰等［5］的研究顯示由真鯛（♀）×黑鯛（♂）所得的雜交子代具有生長速度快、適溫鹽廣、營養價值高、抗病能力強等特點。雖然現有研究顯示真鯛（♀）×黑鯛（♂）的雜交子代呈現出明顯的雜交優勢，但尚不清楚雜交子代的遺傳物質構成情況。筆者采用核型和AFLP分析，研究了真鯛、黑鯛及雜交子代的遺傳構成。

核型和AFLP分析作為遺傳學研究的有效手段，被廣泛的應用于海洋生物學的研究中，如雜交子代的染色體組成與雙親的差異分析［6］，群體遺傳結構的檢測［7—8］、種質鑒定［9］、遺傳連鎖圖譜的構建［10—13］、基因定位［14］等。本研究不但能了解雜交育種后代的染色體組成、與雙親染色體組型的差異和雜種染色體的歸宿，而且能掌握親本和子代3個群體的遺傳結構，互為補充更能揭示雜交子代雜種優勢的遺傳情況，其結果可以為雜種優勢研究和鯛科魚類雜交育種實踐提供理論依據和參考資料。

2 材料與方法

2.1 材料

實驗用真鯛、黑鯛、雜交子代各10尾，均取自浙江象山港灣水產苗種有限公司，真鯛平均體質量29.5 g、體長12.9 cm，黑鯛平均體質量24.9 g、體長11.8 m，雜交子代平均體質量30.5 g，體長11.8 cm。

AFLP試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；PHA、秋水仙素購自Sigma公司；甲醇、乙酸、硝酸銀等均購自生工生物工程（上海）有限公司；TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等購自寶生物工程 （大連）有限公司。

2.2 染色體標本制備與核型分析

以體細胞體內培養法制備真鯛、黑鯛及雜交子代的染色體標本，具體為：按10μg／g魚體質量劑量體腔注射PHA，16～36 h后再按3μg／g魚體質量劑量體腔注射秋水仙素溶液，4 h后取頭腎，以常規空氣干燥法制備染色體玻片標本，經0.037 5 mol／L的氯化鉀溶液低滲處理和固定液（甲醇：乙酸＝3∶1）固定，Giemsa液染色后鏡檢。

對真鯛、黑鯛及雜交子代的染色體標本分別取100個染色體分散良好的中期分裂相進行染色體計數，并選出10個清晰的中期分裂相進行顯微照相、放大和測量。按Levan等［15］的標準對染色體進行分類；按Corman［16］的方法統計臂數，即中部和亞中部著絲粒染色體的臂數計為2，亞端部和端部著絲粒計為1。

2.3 AFLP擴增與分析

以常規酚／氯仿／異戊醇法提取真鯛、黑鯛、雜交子代的基因組DNA。參照王志勇等［17］的方法進行AFLP擴增。通過預實驗篩選出能在3種魚種擴增到清晰條帶的2對AFLP選擴引物組合（E－AAC／M－CCT和E－ACA／M－CGA）進行擴增分析，引物序列見表1。擴增產物經8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離條帶，硝酸銀染色后凝聚成像。參照嚴駿驄等［18］和王曉清等［19］的方法進行條帶統計和數據分析。有關計算公式參照如下：

式中，Nij為個體i與j共有的片段數量，Ni、Nj分別為個體i與j各自具有的片段數量；

式中，S為相似系數。

表1 AFLP選擴引物序列Tab.1 Sequence of AFLP selective amplification pri mer

3 結果

3.1 真鯛、黑鯛及其雜交子代的染色體核型

中期染色體觀察計數結果顯示真鯛、黑鯛和雜交子代中染色體數為48的分裂相分別占總數的68%、77%和60%（表2），因此確定三者的染色體眾數均為48。

表2 不同染色體數目的分裂相個數占全部分裂相個數的百分比Tab.2 The percentage of different number of chromosomes split phase number

真鯛、黑鯛和雜交子代的染色體中期分裂相見圖1。真鯛染色體核型為2n＝2st＋46t，NF＝48（見圖1a）；黑鯛染色體核型為2n＝4 m＋4sm＋2st＋38t，NF＝56（見圖1b）；雜交子代染色體核型為2n＝30 m＋8sm＋2st＋8t＝48，NF＝86（見圖1c）。真鯛的染色體只有st和t兩種類型；黑鯛的染色體有st、t、sm和m 4種類型。雜交子代雖然染色體類型與黑鯛相同，但各類型染色體數目與黑鯛不同：黑鯛染色體以t型居多，而雜交子代則是m型居多。

3.2 真鯛、黑鯛及其雜交子代的AFLP分析

兩對AFLP選擇性擴增引物組合（E－AAC／M－CCT和E－ACA／M－CGA）對真鯛、黑鯛及雜交子代的擴增結果顯示，共檢出擴增條帶278個；真鯛特有條帶108條，有67條出現在雜交子代中；黑鯛特有條帶93條，有21條出現在雜交子代中；雜交子代中出現了15條非親條帶（表3）。

圖1 中期分裂相染色體及核型Fig.1 The metaphase chromosome and karyotype

表3 AFLP擴增條帶統計Tab.3 Numbers of amplified bands with 2 AFLP selective primer pairs

AFLP條帶計算出雜交子代與真鯛、黑鯛的相似系數分別為0.350和0.113，雜交子代個體間的相似系數為0.709；雜交子代與真鯛、黑鯛的遺傳距離分別為1.050和2.180，雜交子代個體間的遺傳距離為0.344。結果顯示雜交子代與母本種（真鯛）的遺傳相似度更高、遺傳距離更近。

4 討論

在雜交育種中，雜交子代由于具有雙親的遺傳物質而同時具有父本種和母本種的一些性狀，并且雜交子代還可能因雙親的遺傳物質的重組而出現一些異于雙親的性狀。如黃帆［20］對高加索三葉草與白三葉雜交后代的遺傳特性進行了研究，結果顯示雜種F1代是雙親真實的雜交后代，其抗旱能力和生育期均介于兩者中間。周麗清等［21—22］對櫛孔扇貝和蝦夷扇貝的正反交子代進行了核型分析，結果顯示正反交子代均為偏向母本類型的異源二倍體，雜交子代顯著提高了櫛孔扇貝的生產性能尤其是抗逆能力。核型分析顯示真鯛、黑鯛、及其雜交子代的染色體數目均為48條，但具體到染色體類型及各類型染色體數目，雜交子代與其父本種和母本種均存在較大差異：雜交子代有15對中部著絲粒染色體，4對亞中部著絲粒染色體，4對端部著絲粒染色體和1對亞端部著絲粒染色體，其父本種（黑鯛）雖然也是有這4種類型的染色體，但數目分別為2對、2對、1對和19對，而母本種（真鯛）則僅有端部（23對）和亞端部（1對）著絲粒染色體。表明真鯛和黑鯛的遺傳物質在雜交過程中發生了較大的重組。

AFLP結果顯示108條真鯛特有條帶中有67條出現在雜交子代中，93條黑鯛特有條帶中有21條出現在雜交子代中，說明子代是同時含有父、母本遺傳物質的真正的雜交種。遺傳相似系數和遺傳距離分析表明，雜交子代與母本種（真鯛）的遺傳相似度更高、遺傳距離更近，說明雜交子代與母本之間具有遺傳同質性，而與父本的遺傳差異則較大。隋班良等［23］對黃姑魚（♀）與大黃魚（♂）雜交子代的AFLP分析結果也顯示雜交子代在遺傳上偏向母本。另外，在雜交子代中還出現了15條非親條帶，這與核型分析結果相互印證，表明父、母本遺傳物質在雜交子代中發生了重組。萬俊芬等［24］對櫛孔扇貝和華貴櫛孔扇貝雜交的ISSR檢測顯示子代中非親位點的出現比例為16.7%～18.7%；何斌等［25］發現櫛孔扇貝和蝦夷扇貝正反雜交子代中分別有12.9% 和14.3%ISSR位點為非親位點。非親位點可能來源于不同長度的擴增片段之間形成的異源雙鏈［26］，或者由于配子形成過程中染色體的不等價交換產生的新序列［27］。遺傳物質的重組可能會產生新的性狀，蔣宏雷等［4］、姜景騰等［5，28］的研究結果均顯示，與父母本相比，其雜交子代表現出明顯的雜交優勢，并具有部分異于雙親的新性狀，如耐低氧能力，這可能與雙親遺傳物質在子代中發生了重組有關。另外，研究結果顯示雜交子代個體間的遺傳相似系數為0.709、遺傳距離為0.344，這可能與父、母本遺傳物質在不同個體中的重組率不同有關。

通過染色體核型分析和AFLP擴增分析，證明了真鯛（♀）×黑鯛（♂）的雜交子代是同時具有父本和母本遺傳物質的異源二倍體，并且父、母本遺傳物質在雜交中發生了一定程度的重組，使雜交子代表現出一定的雜交優勢，但這些優良性狀能否穩定遺傳還需要做進一步的追蹤研究。本研究為今后更加深入地研究雜交子代的生長、抗逆、抗病等特性提供了理論基礎，也為探討雜交優勢的遺傳機制提供了參考資料。

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