絲素蛋白／殼聚糖／納米羥基磷灰石骨組織工程支架材料的體外細胞毒性評價＊

馬立坤，葉 鵬，鄧 江，黃文良，田仁元，呂雪峰

（遵義醫學院第三附屬醫院骨科，貴州 遵義 563000）

理想的骨組織工程支架材料首先應具備良好的生物相容性，合適的孔徑及生物降解性［1，2］。絲素蛋白（silk fibroin，SF）、殼聚糖（chitosan，CS）、納米羥基磷灰石（nano Hydroxyapatite，HA）均是天然生物材料，具有無毒、良好的生物相容性及降解性［3～5］，分別在骨組織工程材料的應用研究中取得一定的成果。而單但獨使用時都存在一些不足。前期實驗將三者按1∶1∶1比例混合制備出SF／CS／n－HA生物支架，在考察其理化特性及表征的基礎上得出三者材料混合比單獨應用更合符骨組織工程要求［6］。骨髓間充質干細胞具有自我復制及向成骨細胞定向分化潛能而成為骨組織工程的理想種子細胞之一［7］。因此，本實驗采用支架與骨髓間充質干細胞共培養通過MTT法及電鏡檢測其材料毒性。

1 材料與儀器

1.1 試劑及儀器 DMEM培養基、胰酶、胎牛血清（Hyelone公司）；MTT（Amresco公司）；DMSO（Amresco公司）；CO2細胞培養箱（Thermo，美國）；離心機（Thermo美國），倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）；超凈工作臺（蘇州安泰有限公司）；掃描電鏡（日立S－3400N，日本）；50萬居里60CO輻照裝置（貴州金農輻照科技有限公司）。

1.2 動物 新西蘭大白兔，清潔級，1月齡，購于第三軍醫大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（渝）2012－0003；實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2012－0002。實驗過程參照2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導意見》對實驗動物進行處置［8］。

2 方法

2.1 SF／CS／n－HA生物三維支架制備 將SF、CS、n－HA按1∶1∶1比例混合，采用冷凍干燥法制備出SF／CS／n－HA生物三維支架，并通過3000Gy60Co照射滅菌后保存備用［6］。經檢測平均孔徑為85.67μm，孔隙率91.25%±2.35%。

2.2 兔骨髓間充質細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells.BMSCs）分離培養 取新西蘭大白兔，麻醉后消毒鋪巾，取出雙側股骨，除去肌肉，PBS清洗。膠骨鉗咬除兩端骨骺，用Hanks液（含肝素抗凝）沖出骨髓，然后用200目過濾篩過濾。1000轉／min離心5min，用含10%牛血清蛋白（FBS）低糖DMEM培養液反復吹打制成單細胞懸液接種于培養瓶，放于細胞培養箱中培養。48小時半換液，72小時小時全換液，以后視情況每隔兩三天換液，待細胞生長至80%～85%時，用胰蛋白酶消化，按1：2進行傳代培養，培養條件同原代。

2.3 支架體外細胞毒性實驗 按培養基與支架體積比1ml／cm3為100%，37℃ 培養箱中浸提24小時，分別制備出濃度為100%、50%、25%浸提液。取第三代BMSCs，以細胞濃度為1×108／L每孔100μl接種到96孔板中，培養24小時后棄原培養基，更換為各濃度組浸提液，以加入完全基為陰性對照組，繼續細胞箱中培養，分別于24、48、72h隨機取一孔板，采用MTT法測定細胞活力。依據ISO10993.5－1999及 GB／T16886.5－2003標準，按下式計算出相對增殖率并評價支架的細胞毒性［9，10］。支架細胞毒性相對增殖率（RGR）＝各濃度實驗組吸光值／陰性對照組吸光值×100%。

2.4 支架細胞活力測定 取第3代BMSCs，以細胞濃度為6×107／L，每孔接種100μl于96孔板中的SF／CS／n－HA支架作為實驗組，以不放支架材料為對照組，細胞箱中培養，分別于1、3、5、7d隨機取一孔板，MTT法測定各孔吸光值。

2.5 細胞黏附率測定 取第3代BMSCs，調整細胞濃度為5×107／L，每孔100μl接種在48孔板中的SF／CS／n－HA支架作為實驗組，對照組為不放支架材料，于細胞箱中培養，分別于1、3、5h細胞計數板計數未附著細胞。細胞黏附率＝（接種細胞數－未附著細胞數）／接種細胞數×100%

2.6 細胞在支架上生長情況觀察：每天倒置顯微鏡下觀察支架周邊細胞生長情況，支架與細胞共培養7天取出支架用2.5%戊二醛固定2小時，梯度酒精脫水，干燥，噴金，掃描電鏡觀察細胞生長。

2.7 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，所得數據用表示。兩者間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為有統計學差異。

3 結果

3.1 支架體外細胞毒性實驗結果 分別測得個濃度組吸光值及陰性對照組吸光值，計算出RGR，通過與材料毒性等級（CTG）對比得出支架材料對BMSCs無細胞毒性，見表1、2。

表1 SF／CS／n－HA支架各濃度組浸提液與BMSCs培養的RGR和CTG（n＝8）Table 1 Various concentrations of SF／CS／n－HA scaffolds extract and BMSCs cultured RGR and CTG

表2 細胞毒性反應分級標準Table 2 Classification standard of cell toxicity

3.2 細胞增殖活力測定結果 隨著時間的增長，細胞在支架上的數量明顯增加，生長良好，支架材料實驗組與對照組在第1、3、5、7d兩組比較有統計學差異（P＜0.05），說明支架實驗組隨著時間增長細胞增殖活力優于不放支架材料的對照組，見表3。

表3 不同時間SF／CS／n－HA支架對細胞增殖活力OD值（，n＝4）Table 3 SF／CS／n－HA scaffolds on cell proliferation activity at different time

表3 不同時間SF／CS／n－HA支架對細胞增殖活力OD值（，n＝4）Table 3 SF／CS／n－HA scaffolds on cell proliferation activity at different time

注：①P＜0.05，VS對照組

組數 時間（d）1 3 5 7實驗組 0.108±0.019①0.250±0.015①0.406±0.022①0.858±0.066①對照組 0.068±0.0020.162±0.0080.307±0.0480.612±0.011

3.3 細胞黏附結果 隨著時間增加實驗組與對照組細胞黏附率均增大，兩組比較無統計學差異（P＞0.05），結果見表4。

3.4 BMSCs原代及傳代培養形態 原代BMSCs接種24小時后開始出現梭形細胞，經半換液全換液除去未貼壁細胞，約72小時細胞開始增殖，生長良好，BMSCs成纖維狀、長梭形。約7天時細胞生長回合達80%～90%。傳代后細胞形態基本一致，細胞以梭形為主，增殖正常，6～8d時細胞可鋪滿瓶底，見圖1。

表4 SF／CS／n－HA支架細胞黏附率［×10－2（，n＝6）］Table 4 SF／CS／n－HA scaffolds on cell adhesion rate

表4 SF／CS／n－HA支架細胞黏附率［×10－2（，n＝6）］Table 4 SF／CS／n－HA scaffolds on cell adhesion rate

1 3 5支架材料組黏附率組別 時間（h）77.500±0.06987.500±0.05289.167±0.038對照組黏附率75.833±0.07485.000±0.05586.667±0.052

圖1 第三代BMSCs培養第7天（×100）Figure 1 The third generation of BMSCs at 7th day（×100）

3.5 細胞在支架上生長觀察 倒置顯微鏡觀察支架周邊細胞生長良好，增殖正常，見圖2。掃描電鏡觀察見細胞在支架材料上伸出偽足緊密黏附在支架孔隙表面。細胞為橢圓形、圓形或多角形，生長良好，分裂正常，見圖3。

圖2 SF／CS／n－HA支架復合BMSCs共培養7d（×100）Figure 2 SF／CS／n－HA scaffolds and BMSCs cultured at 7th d（×100）

4 討論

骨缺損修復是骨科的重要研究課題之一。當前治療骨缺損主要采用自體或異體骨移植，但都存在一定的弊端［11］。隨著骨組織工程的發展，為骨缺損治療帶來了新的思路。支架材料、種子細胞、細胞因子是骨組織工程的研究熱點［12］。一種理想的支架首先必須與種子細胞具有良好的生物相容性［13］。

圖3 SF／CS／n－HA支架復合BMSCs共培養7dSEM（×2000）Figure 3 SF／CS／n－HA scaffolds and BMSCs cultured at 7th d（×2000）

目前材料的細胞毒性評價主要首選體外細胞毒性評價，通過MTT法檢測種子細胞與支架材料共培養的相對增值率［14］。MTT法具有快速、重復性好、檢測結果靈敏等特點而廣泛用于生物材料的細胞毒性檢測［15］。其檢測原理為活細胞中具有豐富的琥珀酸脫氫酶，能將MTT還原成不容于水的藍紫色結晶物質，而該結晶物質能溶解于DMSO，通過酶聯免疫檢測儀測定其吸光值來間接反映細胞存活量［16］。死細胞中無琥珀酸脫氫酶，不具備此功能。本實驗采用的支架材料為實驗組前期研究中制備的絲素蛋白／殼聚糖／納米羥基磷灰石復合支架，通過檢測具有符合骨組織工程支架材料的孔徑、孔隙率等要求［6］。顯示支架材料與組織來源不同的種子細胞具有不同的相容性［17］。因此，采用此材料與實驗目的一致的種子細胞BMSCs體外共培養來評價支架材料的生物相容性，這樣所得結果才更加準確和客觀。

RGR進行細胞毒性分級評價是國內外學者廣泛采用的方法［18］。理想的組織工程支架材料除了要求對種子細胞無毒性作用外，還應能促進種子細胞的黏附增殖［19］。

5 結論

BMSCs在CS／SF／n－HA復合支架上具有良好的黏附作用。隨著時間的增加能明顯促進BMSCs增殖，進一步表明此支架具有良好細胞相容性，是一種理想的骨組織工程支架。但該支架在體內的組織相容性、生物降解性、免疫源性及修復骨缺損的療效需進一步研究。

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