利用GS技術選育耐高溫高糖葡萄糖酸鹽生產菌

沈玉平 張祖姣

（湖南科技學院 生命科學與化學工程系，湖南 永州 425199）

葡萄糖酸鹽主要用于人體微量元素補充[1]和建筑添加劑，在食品、建筑行業有著廣泛的應用。

葡萄糖酸鹽主要通過微生物發酵法生產。我國大部分地區夏季溫度高、時間跨度長。因此，夏季生產必然導致能卻能耗的增加。此外，在葡萄糖酸發酵過程中，采用高濃度葡萄糖發酵，葡萄糖的分解產生高濃度的葡萄糖分解代謝物如葡萄糖酸、丙酮酸等阻遏物，阻遏葡萄糖氧化酶的合成[2]，延長發酵時間。因此，選育具有耐高溫、高糖性狀的葡糖糖酸鹽生產菌株具有重要的意義。

基因組改組（GS, Genome Shuffling）技術是分子定向進化在全基因組水平上的延伸，它以整個基因組為操作對象，模擬生物進化過程，將具有不同正突變的多個全基因組進行隨機重組，從而快速選育出高產優質菌株或目的性狀得到較大改進的菌株。Zhang Ying-Xing[3]等通過基因組改組快速提高了弗氏鏈霉菌生產泰樂星的能力。Ranjan Patnaik[4]等通過基因組改組提高了乳酸菌的耐酸能力，大大提高了乳酸的合成能力。Genome Shuffling技術最大的優點就是可以在基因型和表型的相關機制不是很清楚的情況下可以迅速將決定某一理想表型的多個甚至十幾個突變基因組合在一起從而達到改進的目的。因此，對于提高微生物的環境耐受性等基因編碼機制尚不清楚的性狀，Genome Shuffling技術有著獨特的優勢。本文在理化誘變的基礎上，利用Genome Shuffling技術選育耐高溫和高初始葡萄糖糖性能優良的改組菌株，并通過搖瓶實驗5 L發酵罐實驗驗證其耐受高溫和初始葡萄糖糖性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

黑曲霉ZBY-7(Aspergillus.niger ZBY-7)[5]，本實驗室保存。菌種保藏于4 ℃的斜面培養基中，每兩個月轉種一次。

1.1.2 試劑

蝸牛酶、 纖維素酶、溶菌酶購于上海勵瑞生物科技有限公司；亞硝基胍（NTG）為FLUKA公司產品，其他化學試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 培養基

斜面培養基：葡萄糖 300 g、KH2PO40.15 g、KCl 0.2 g、MgSO4.7H2O 0.12 g 、(NH4)2HPO40.6 g、瓊脂 20 g，蒸餾水1000mL，自然pH。

初篩培養基：參閱文獻[6]。

發酵培養基：葡萄糖 300 g、MgSO4.7H2O 0.15 g 、KH2PO40.35 g、CaCO335 g、尿素 0.55 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。

原生質體再生培養基[6,7]：初篩培養基中加入 0.6M 的MgSO4滲透壓穩定劑即可。

1.2 方法

1.2.1 亞硝基胍-紫外誘變

挑取新鮮斜面上孢子將濃度調整到 1×106個/ml，制成孢子懸液。準確稱取5mg 亞硝基胍加入到6 cm無菌培養皿中，用1滴丙酮助溶，加入5 ml孢子懸液，在功率為15 W，距離為30 cm的紫外燈下分別照射0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 min，在紅光下取處理后的孢子懸液0.1ml涂布于平板上，培養后菌落計數，繪制致死曲線。

1.2.2 正突變基因庫的獲得

出發菌株經亞硝基胍-紫外誘變，37 ℃、30 % 初始葡萄糖濃度條件下耗糖速率大于出發菌株30 ℃、10 % 初始糖濃度條件下耗糖速率的突變株為正突變株。

1.2.3 基因組改組

1.2.3.1 原生質體的制備 參閱文獻[7]。

1.2.3.2 原生質體的滅活 將原生質體于 50 ℃水浴處理1、2、3、4、5 min，計算原生質體的致死率。

1.2.2.3 基因組改組 將各正突變株原生質體按1：1比例混合，在25 %聚乙二醇（PEG）6000、0.01 mol/L CaCl2溶液促融下對個正突變株的整個基因組進行隨機重組，并通過定向篩選技術篩選出耐受高溫、高初始葡萄糖性狀得到提高的改組菌株。

1.2.4 篩選方法

1.2.4.1 初篩 根據初篩平板上透明圈的大小進行初篩。

1.2.4.2 復篩 黑曲霉發酵生產的葡萄糖酸導致發酵液pH，從而抑制菌株繼續產酸，因此搖瓶發酵時采用 CaCO3中和產生的葡萄糖酸，以達到調節pH的目的。葡萄糖酸鈣的溶解度很低（40 g.L-1），未溶解的葡萄糖酸鈣以晶體的形式吸附在菌體上。因此，檢測發酵液中的葡萄糖酸鈣的含量不能真實的反應發酵所產生的葡萄糖酸。劉建忠[8]經多年研究發現，黑曲霉 ZBY-7發酵消耗的葡萄糖幾乎完全被用來產酸，葡萄糖的消耗量能夠真實的反應菌株在發酵過程中葡萄糖酸的產生量。因此，本文通過檢測發酵液中殘糖含量，以葡萄糖的消耗速率（mg.h-1.mL-1）表征菌株的產酸能力。

1.2.5 葡萄糖的測定

葡萄糖的測定采用氧化還原滴定法[8]。

1.2.6 5 L發酵罐水平實驗

在搖瓶實驗的基礎上，在5 L發酵罐水平上考察高濃度初始糖、高溫條件下改組菌株發酵狀況。發酵條件為pH 6.0，溫度37℃，初始葡萄糖濃度為30%，轉速 950 rpm 通氣量前2 h 為2 vvm，以后均為8 vvm，采用40% NaOH作為 pH調節劑，依據流加NaOH的體積計算發酵過程中產生的酸。

2 結果與分析

2.1 亞硝基胍-紫外線誘變

通過紫外線、亞硝基胍處理，其處理時間和致死率關系如圖1。

研究表明，致死率85%左右比較容易獲得正突變株，因此我們選擇3.0 min的處理時間。

圖1.亞硝基胍-紫外線誘變會致死曲線

2.2 正突變基因庫的獲得

本文通過經典的亞硝基胍-紫外線誘變獲取基因組改組所需的正突變基因組庫。以黑曲霉 ZBY-7為出發菌株度，亞硝基胍、紫外線處理3 min，獲得正突變株9株，其耗糖速率如表1。

表1 突變株耗糖速率

從表1我們可以看出，在初始葡萄糖濃度提高到30 %，發酵溫度提高到37 ℃情況下，突變耗糖速率較出發菌株有較大幅度的提高，其中最高的一株 A.niger-NU-3 較出發菌株提高12.48 %。這證明，通過誘變，各正突變株初步具有了耐高溫高糖的性能。

2.3 原生質體滅活

原生質體分別處理 1、2、3、4、5min，其致死情況見圖2。

圖2.黑曲霉原生質體滅活致死曲線

從圖2我們可以看出，熱滅活能夠完全滅活黑曲霉原生質體。因此，為排除基因組改組過程中親本的干擾，我們采用的50 ℃,水浴5 min的滅活方式進行親本滅活。

2.4 基因組改組

以亞硝基胍-紫外線誘變所獲得的 9株正突變株為出發菌株進行基因組改組，獲得8株正融合株，結果如表2所示。其中耗糖速率最高的一株為 3.00mg.h-1.mL-1，命名為A.niger-GS-30，其耗糖速率較出發菌株提高28.21%。

表2融合子的耗糖速率

A.niger-GS-30 3.00 A.niger-GS-34 2.98 A.niger-GS-42 2.93 A.niger-GS-58 2.94 A.niger-GS-62 2.96

在此次基因組改組中，菌株的耗糖速率未得大幅度提高，這可能是菌株的耗糖能力已接近極限，很難再提高；也有可能是由于遺傳背景差異較小造成的，在今后的改組中，可以采用不同的誘變劑誘變獲得遺傳背景差異較大的菌株，可能會取得更好的效果。

2.5 5 L發酵罐水平發酵實驗

為驗證耐高糖高溫菌株A.niger-GS-30在發酵罐水平上是否具有可信性和可重復性，本實驗進行了5L發酵罐的葡萄糖酸鈉的發酵實驗。發酵過程中，對殘糖（RG）和葡萄糖酸鈉的產量（以葡萄糖酸鈉的濃度表示，g.L-1）作了檢測，并將與出發菌株作了比較，結果如圖3。

圖3.A.niger-GS-30在 5 L發酵罐水平上殘糖濃度變化-葡萄糖酸鈉產量關系圖

圖中“◆”為出發菌株殘糖A.niger-ZBY-7含量，“◇”為出發菌株 A.niger-ZBY-7葡萄糖酸鈉含量；“▼”為改組菌株 A.niger-GS-30殘糖含量，“◇”為改組菌株A.niger-GS-30葡萄糖酸鈉含量。

從圖3中我們可以看出，在高初始糖濃度高溫條件下，隨著葡萄糖濃度的下降，葡萄糖酸鈉濃度持續升高。A.niger-GS-30發酵2小時時已經流加開始NaOH，說明菌體已經開始產酸，而出發菌株直到發酵 4小時后才開始流加NaOH。比起出發菌株，A.niger-GS-30的適應期縮短2h。發酵時間上，在同為30%的初始糖濃度下，出發菌株的發酵時間為36h，而A.niger-GS-30的發酵時間為33h，發酵時間縮短3h。

從發酵的效果看，A.niger-GS-30產率為40.82 g.h-1，比出發菌株37.12 g.h-1的產率提高9.97 %；A.niger-GS-30的轉化率與出發菌株相當，分別為113.03%和111.96%。無論是發酵的產率還是轉化率，A.niger-GS-30都比出發菌株有一定的提高。

3 結論

3.1 通過亞硝基胍-紫外線復合誘變，初步獲得具有耐受高溫高糖性能的突變株，作為正突變株基因庫。

3.2 熱滅活5 min 可完全滅活黑曲霉原生質體，可有效的排除基因組改組后改組菌株篩選的干擾。

3.3 通過基因組改組，獲得一株能耐受37 ℃高溫，30 %初始葡萄糖的改組菌株，其耗糖速率較出發菌株提高28.2 %，發酵溫度提高7 ℃，初始葡萄糖耐受濃度由10 %提高到30 %。

4 討論

本文通過基因組改組成功獲得一株耐高溫高糖的葡萄糖酸鹽生產菌，無論耗糖速率還是發酵溫度及初始糖耐受濃度均得到較大提高。這說明，在現今環境耐受性能的機制及基因編碼控制尚未完全弄清楚的情況下，使用 Genome shuffling技術提高菌株的環境耐受性仍不失為一種快速便捷的方法。但是，如果不采用多元化來源的正突變基因庫，其性能提高幅度將大大降低。在本文中，基因組改組的出發菌株均為亞硝基胍-紫外線復合誘變后的正突變株，其遺傳背景差異較小，因此，本次改組雖然耐高溫高糖的性能得到較大提高，但葡萄糖的耗糖速率卻提高有限。此外，如果不采用合理的方法定向篩選改組菌株，也將大大增加篩選的工作量。在本文中，采用熱滅活的方法排除親本的干擾，并通過透明圈的方法進行初篩，這樣就大大減少了定向篩選的工作量。

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[3]Zhang Y X, Perry K, Vinci V A, et al.Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria[J].Nature,2002, 415:644-646.

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[5]計亮年,劉建忠,楊惠英,等.黑曲霉發酵葡萄糖生產葡萄糖酸鎂(錳)[P].中國發明專利, CN1188152, 1997-12-17.

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[7]姚婷婷,王正祥.黑曲霉原生質體的制備、再生及轉化條件[J].食品與生物技術學報, 2006,25(4):116-119.

[8]劉建忠.金屬離子地黑曲霉生物合成酶的影響及其作用[D].廣州:中山大學, 2001.