毛冬青根提取液不同部位的血小板聚集抑制活性

林麗萍+李英+呂曄

摘要：采用萃取和柱層析法制備毛冬青各提取部位；用Born比濁法，以ADP為誘導劑檢測毛冬青根提取液各部位對血小板聚集的抑制率，從而確定毛冬青根抗血小板聚集的有效部位。結果表明，各部位均具有不同程度的抑制效果。其中水部位和D101-95%乙醇部位活性最強，且在0.08～0.5 mg/mL范圍內，隨著劑量的增加，其活性也隨之加強，抗血小板聚集活性與劑量呈正相關。

關鍵詞：毛冬青；提取部位；抗血小板聚集

中圖分類號：R285 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0289-02

毛冬青為冬青科（Aquffoliaceae）冬青屬植物毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Am.）的干燥根，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒之功效。已有研究結果表明毛冬青制劑有擴張血管及抗菌消炎的作用，臨床用于冠狀動脈硬化性心臟病，血栓閉塞性脈管炎，并用于中心性視網膜炎，小兒肺炎等疾病的治療，有顯著療效^[1]。查閱大量文獻可知，當前報道的毛冬青中具有抗血小板聚集活性的單體化合物有毛冬青甲素^[2]、毛冬青酸^[3-4]、Ilexosides D^[5]、Ilexosides J^[6]、Ilexgenin A、縮醛基毛冬青化合物R4^[7]、Pubescenosides A和Pubescenosides B^[8]8種。此外，筆者以Ilexgenin A為先導化合物進行結構修飾，也得到了一系列具有抗血小板聚集活性的衍生物^[9]。然而，究竟毛冬青根提取液中哪個部位抗血小板聚集活性高，前人沒有做過詳細的研究。本研究利用萃取和柱層析的方法，獲得毛冬青根提取液的不同極性部位，以ADP為誘導劑，測定它們對血小板聚集的抑制效果，為后續有效成分的分離純化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

新西蘭大耳白兔♀兼用，體質量1.7～2.0 kg，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供。

1.2 藥物與試劑

毛冬青于2012年采自廣西，經廣西藥用植物園韋發南研究員鑒定為毛冬青科冬青屬植物毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Am.）的干燥根，留樣樣品保存在本所標本館；柱層析硅膠和薄層層析硅膠（青島海洋化工有限公司產品）；阿司匹林（Sigma，貨號：A2093）；甲醇、正丁醇、二氯甲烷、乙醇、DMSO均為國產分析純（上海實意化學試劑有限公司產品）。

1.3 儀器

普通層析柱，超聲儀，型號KQ2200B，昆明市超聲儀器有限公司產品；低溫離心機，型號1-15K，Sigma Corporation公司產品；血小板聚集儀，型號LBY-NJ，北京普利生儀器有限公司產品。

1.4 毛冬青提取液各部位的制備

將毛冬青根原材料粉碎后，70%乙醇回流提取3次，每次3 h，提取液濃縮得浸膏。浸膏水溶（1 kg ∶2 L）超聲懸浮得水懸浮液，依次用石油醚和水飽和的正丁醇萃取，得正丁醇部位和水部位。正丁醇部位減壓旋蒸、水浴蒸干，甲醇溶解上D101大孔樹脂柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇沖柱，得D101-水部位、D101-30%乙醇部位、D101-50%乙醇部位、D101-70%乙醇部位和D101-95%乙醇部位。取各部位分別濃縮蒸干后各取粉末5 mg，以0.5% DMSO作為溶媒，各部位分別配置0.08、0.20，0.50 mg/mL 3個濃度備用。

1.5 血小板聚集率測定

1.5.1 血漿樣品的制備

取健康新西蘭大耳白兔，靜脈注射20%烏拉坦1 g/kg 麻醉，頸總動脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝（血與抗凝劑體積比為9 ∶1）。室溫下1 000 r/min離心 15 min，吸取上層富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），剩余血液3 000 r/min 離心15 min，吸取上清液貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）。制備好的PRP應在3 h內用完。

1.5.2 體外抗血小板聚集試驗

取新西蘭大耳白兔，按“1.5.1”節方法制備PRP和PPP。用PPP調整PRP中血小板數為（3～4）×1011個/L。以0.5% DMSO作為溶媒對照，測定時以PPP調零。精密吸取15 μL溶媒或藥物溶液加入到270 μL PRP中，在37 ℃比濁杯內孵育5 min，用PPP調零，再加入誘導劑 ADP 溶液15 μL（終濃度為10 μmol/L），按Born比濁法測定血小板聚集率，記錄5 min內最大聚集率。血小板聚集抑制率=（對照組最大聚集率-藥物組最大聚集率）/對照組最大聚集率×100%。

1.5.3 統計學方法

所有試驗數據均以“x±s”表示，采用SPSS 18.0進行t檢驗。

2 結果

與對照組相比，D101-70%乙醇部位0.2 mg/mL和 0.5 mg/mL 均顯著抑制ADP誘導的新西蘭大耳白兔血小板聚集（P<0.05），毛冬青浸膏、水部位、正丁醇部位、D101-水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位均極顯著抑制ADP誘導的新西蘭大耳白兔血小板聚集（P<0.01）（表1）。

3 討論

毛冬青是我國常用中藥之一，臨床應用廣泛，在治療血栓方面表現出較好的療效。本試驗結果表明，毛冬青具有顯著抗血小板聚集的活性，毛冬青浸膏、水部位、正丁醇部位、D101-水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位，均可極顯著地抑制血小板聚集，且呈劑量依賴關系；在 0.5 mg/mL 時，其抑制作用強度也均高于陽性對照藥阿司匹林。在本次試驗劑量范圍內，水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位在抗血小板聚集方面較為顯著，因此可判定其抗血小板聚集的有效部位是水部位、D101-50%乙醇部位和D101-95%乙醇部位。下一步試驗需對具有抗血小板聚集作用的有效部位進一步分析，以期分離純化有效成分和探索其藥理作用。endprint

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