黃芪建中湯對慢性阻塞性肺疾病穩定期大鼠mtDNAATPase6、ATPase8基因表達的影響

魏姍姍　徐升　張念志

摘要：目的探討黃芪建中湯對慢性阻塞性肺疾病（COPD）穩定期大鼠mtDNA ATPase6、ATPase 8基因表達的影響。方法將120只SD大鼠隨機分為6組：即A組（正常對照組）、B組（COPD模型組）、C組（黃芪建中湯高劑量組）、D組（黃芪建中湯中劑量組）、E組（黃芪建中湯低劑量組）、F組（金水寶膠囊組），每組20只。后五組采用氣管內注射脂多糖（LPS）加煙熏的方法制作COPD大鼠模型，造模成功后，各治療組分別給藥8周，采用RT-PCR方法檢測大鼠動脈血mtDNA ATPase6、ATPase 8基因表達變化。結果A組的熒光生長曲線呈明顯陽性；B組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8熒光反應較A組明顯下降（P<0.01）；與B組相比：C組、D組、E組、F組熒光反應明顯升高（P<0.01），升高的次序為C組>D組>F組。C組與D組之間差異顯著（P<0.05），D組與E組之間差異顯著（P<0.05），C組、D組與F組之間差異顯著（P<0.05）。結論模型組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8基因表達量減少，黃芪建中湯對mtDNA ATPase 6、ATPase 8的基因表達有明顯的保護與恢復作用，療效優于金水寶膠囊組。

關鍵詞：COPD；黃芪建中湯；mtDNA ATPase6、8

中圖分類號：R563.9文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2014）05-0071-03

【Abstract】Objective：To study the effect of Huangqi Jianzhong Decoction（HJD）on mtDNA ATPase 6，ATPase 8 gene expression of chronic obstructive pulmonary（COPD）in stationary phase. Methods：120 SD rats were randomly divided into six groups，Group A（control group），Group B（COPD model group），Group C（HJD high-dose group），Group D（HJD medium-dose group），Group E（HJD medium low-dose group），Group F（Jinshuibao Capsule group），20 rats per group. The latter five groups were given with LPS intratracheal injection plus smoked way to induce COPD rats. Each of the treatment group was administered for 8 weeks. RT-PCR method was used to detect the changes of the mtDNA ATPase 6，ATPase 8 gene expression of arterial blood of the rats. Results：The fluorescence growth curve of Group A was significantly positive，the fluorescence response of the mtDNA ATPase 6、ATPase 8 of Group B was significantly lower than that of Group A（P<0.01）. Compared with Group B，the fluorescence response of Group C，D，E，F was significantly higher（P<0.01），and their increase order was Group C>Group D>Group F. The difference between Group C and D was significant（P<0.05），the difference between Group D and E was significant（P<0.05），the difference between Group C，D and E was significant（P<0.05）. Conclusion：The gene expression of the mtDNA ATPase 6、ATPase 8 of the model rats decrease and Huangqi Jianzhong Decoction could protect and restore the gene expression ans has a better effect than that of Jinshuibao capsule group.

【Key words】COPD，HuangqiJianzhong Decoction，mtDNA ATPase 6 and Pase 8

慢性阻塞性肺疾病（COPD）近年來發病率呈明顯上升趨勢，是世界范圍內重要的致殘、致死原因。COPD患者普遍存在免疫力低下、營養不良、呼吸肌疲勞等問題，單獨的營養支持并不能有效遏制病情的進展。COPD穩定期主要以鞏固防復發，提高人體正氣以防外邪為目的，臨床發揮中醫固本治療的特色，采用黃芪建中湯治療COPD穩定期患者療效顯著，且優于補益肺腎法。本課題以COPD模型大鼠為研究對象，觀察COPD大鼠mtDNA ATPase6、8基因表達的改變，從基因與轉錄水平來探討建中補虛法治療COPD的作用機制。

1研究方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠，體重（250±10）g，共120只，由安徽省實驗動物中心提供（動物合格證號：scxk（皖）2011-002）。動物自由飲水和攝食，溫度20℃～23℃，相對濕度70%，適應性喂養1周。endprint

1.2藥物與試劑黃芪建中湯（黃芪5 g，白芍20 g，飴糖30 g，桂枝10 g，生姜9 g，炙甘草6 g，大棗6枚）購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，常規煎法，并濃縮成相應濃度。金水寶膠囊由江西金水寶制藥有限公司出品（批準文號：（89）衛藥準字z-18號，批號：011101）；脂多糖/內毒素（美國Sigma公司，L-2880，10 mg/支）；羅丹明123（Rh123，為美國Sigma公司產品）；真龍牌香煙（廣西中煙工業有限責任公司出品，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量13 mg）；Trizol Reagent（invitrogen公司，貨號：15596-026）；逆轉錄試劑盒（Fermentas公司，貨號：00064525）；PCR試劑和Taq DNA聚合酶（Fermentas公司 美國）；氯仿、無水乙醇、異丙醇（上海中試化學試劑有限公司）；DEPC（Sigma公司）；引物及探針合成（invitrogen公司）；熒光定量試劑（TaKaRa公司）。

1.3分組、模型制作及給藥方法將動物隨機分為6組：即A組（正常對照組）、B組（COPD模型組）、C組（黃芪建中湯組高劑量組）、D組（黃芪建中湯組中劑量組）、E組（黃芪建中湯組低劑量組）、F組（金水寶膠囊組），每組20只。按照宋一平等[1]介紹的方法（香煙霧熏加LPS氣管滴入法）復制大鼠COPD模型，即制模開始后1 d和14 d向氣管內滴入LPS各1 g/L，2～13 d和15～60 d每日在80 cm×50 cm×40 cm密閉箱內香煙霧熏30 min（烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg），每次10支。黃芪建中湯常規煎法，并濃縮成相應濃度。給藥劑量分別為低劑量組2.8 g/kg/d，中劑量組5.6 g/kg/d，高劑量組11.2 g/kg/d（以上均為生藥量），分別相當于臨床用量的5、10、20倍，金水寶膠囊組給藥劑量為0.5 g/kg/d，相當于臨床用量的10倍，灌胃8周。

3討論

目前，從脾論治COPD的研究較為活躍，不僅有理論探討、臨床療效觀察，而且還涉及到作用機理方面的研究，機理研究方面已涉及到抗炎性介質、抗氧化、細胞免疫調節以及病理學的改變等內容。但綜觀目前的研究現狀，指標的相關性不夠明確，特異性不強，因此中醫作用機制及靶點所在尚不明確。眾所周知，線粒體是整個細胞乃至生命體進行各項生命功能活動的樞紐和核心，線粒體作為氧化磷酸化場所，主要功能是合成和利用ATP，為細胞生命活動提供能量。催化此能量偶聯反應的酶為F0F1-ATPase，它位于線粒體內膜的基質側，主要由F0和F1組成。ATPase 6、ATPase 8是F0F1-ATPase疏水部分F0的兩個亞基，由mtDNA ATPase6、ATPase8基因編碼。F0部分是鑲嵌在線粒體內膜的質子通道，當H+順濃度梯度經F0回流時F1催化ADP和Pi生成并釋放ATP[2]。ATPase6亞基在線粒體電子轉遞鏈的氧化磷酸化過程中起質子泵作用，而ATPase8亞基主要與ATP合成酶活性有關[3～4]。

本實驗中模型組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8熒光表達水平明顯下降，說明ATP酶合成減少，線粒體能量代謝障礙；而治療組相較于模型組熒光表達水平明顯升高，說明黃芪建中湯具有對抗內毒素和煙霧造成的ATPase 6、ATPase 8基因表達下調，提高ATPase活性，改善細胞能量供應而發揮其保護效應。

參考文獻：

[1]中華醫學會呼吸病學分會·慢性阻塞性肺疾病診治指南[J]·中華結核和呼吸雜志，2002，25：453-460.

[2]Ronnemaa T，KnipM，Lautala P，et al.Serum insulin and other cardio 2 vascular risk indicators in children，adolescents and young adults[J].AnnMed，199，l 23（1）：67-72.

[3]MustA，DallalGE，DietzWH.Reference data for obesity：85th and 95th percentiles of body mass index（wt/ht2）and triceps skinfold thickness[J].Am JClinNutr，1991，53（4）：839-846.

[4]BellizziMC，DietzWH.Workshop on childhood obesity：Summary of the discussion[J].Am JClinNutr，1999，70（1）：173-175.

（收稿日期：2014-03-07）endprint

1.2藥物與試劑黃芪建中湯（黃芪5 g，白芍20 g，飴糖30 g，桂枝10 g，生姜9 g，炙甘草6 g，大棗6枚）購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，常規煎法，并濃縮成相應濃度。金水寶膠囊由江西金水寶制藥有限公司出品（批準文號：（89）衛藥準字z-18號，批號：011101）；脂多糖/內毒素（美國Sigma公司，L-2880，10 mg/支）；羅丹明123（Rh123，為美國Sigma公司產品）；真龍牌香煙（廣西中煙工業有限責任公司出品，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量13 mg）；Trizol Reagent（invitrogen公司，貨號：15596-026）；逆轉錄試劑盒（Fermentas公司，貨號：00064525）；PCR試劑和Taq DNA聚合酶（Fermentas公司 美國）；氯仿、無水乙醇、異丙醇（上海中試化學試劑有限公司）；DEPC（Sigma公司）；引物及探針合成（invitrogen公司）；熒光定量試劑（TaKaRa公司）。

1.3分組、模型制作及給藥方法將動物隨機分為6組：即A組（正常對照組）、B組（COPD模型組）、C組（黃芪建中湯組高劑量組）、D組（黃芪建中湯組中劑量組）、E組（黃芪建中湯組低劑量組）、F組（金水寶膠囊組），每組20只。按照宋一平等[1]介紹的方法（香煙霧熏加LPS氣管滴入法）復制大鼠COPD模型，即制模開始后1 d和14 d向氣管內滴入LPS各1 g/L，2～13 d和15～60 d每日在80 cm×50 cm×40 cm密閉箱內香煙霧熏30 min（烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg），每次10支。黃芪建中湯常規煎法，并濃縮成相應濃度。給藥劑量分別為低劑量組2.8 g/kg/d，中劑量組5.6 g/kg/d，高劑量組11.2 g/kg/d（以上均為生藥量），分別相當于臨床用量的5、10、20倍，金水寶膠囊組給藥劑量為0.5 g/kg/d，相當于臨床用量的10倍，灌胃8周。

3討論

目前，從脾論治COPD的研究較為活躍，不僅有理論探討、臨床療效觀察，而且還涉及到作用機理方面的研究，機理研究方面已涉及到抗炎性介質、抗氧化、細胞免疫調節以及病理學的改變等內容。但綜觀目前的研究現狀，指標的相關性不夠明確，特異性不強，因此中醫作用機制及靶點所在尚不明確。眾所周知，線粒體是整個細胞乃至生命體進行各項生命功能活動的樞紐和核心，線粒體作為氧化磷酸化場所，主要功能是合成和利用ATP，為細胞生命活動提供能量。催化此能量偶聯反應的酶為F0F1-ATPase，它位于線粒體內膜的基質側，主要由F0和F1組成。ATPase 6、ATPase 8是F0F1-ATPase疏水部分F0的兩個亞基，由mtDNA ATPase6、ATPase8基因編碼。F0部分是鑲嵌在線粒體內膜的質子通道，當H+順濃度梯度經F0回流時F1催化ADP和Pi生成并釋放ATP[2]。ATPase6亞基在線粒體電子轉遞鏈的氧化磷酸化過程中起質子泵作用，而ATPase8亞基主要與ATP合成酶活性有關[3～4]。

本實驗中模型組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8熒光表達水平明顯下降，說明ATP酶合成減少，線粒體能量代謝障礙；而治療組相較于模型組熒光表達水平明顯升高，說明黃芪建中湯具有對抗內毒素和煙霧造成的ATPase 6、ATPase 8基因表達下調，提高ATPase活性，改善細胞能量供應而發揮其保護效應。

參考文獻：

[1]中華醫學會呼吸病學分會·慢性阻塞性肺疾病診治指南[J]·中華結核和呼吸雜志，2002，25：453-460.

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[3]MustA，DallalGE，DietzWH.Reference data for obesity：85th and 95th percentiles of body mass index（wt/ht2）and triceps skinfold thickness[J].Am JClinNutr，1991，53（4）：839-846.

[4]BellizziMC，DietzWH.Workshop on childhood obesity：Summary of the discussion[J].Am JClinNutr，1999，70（1）：173-175.

（收稿日期：2014-03-07）endprint

1.2藥物與試劑黃芪建中湯（黃芪5 g，白芍20 g，飴糖30 g，桂枝10 g，生姜9 g，炙甘草6 g，大棗6枚）購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，常規煎法，并濃縮成相應濃度。金水寶膠囊由江西金水寶制藥有限公司出品（批準文號：（89）衛藥準字z-18號，批號：011101）；脂多糖/內毒素（美國Sigma公司，L-2880，10 mg/支）；羅丹明123（Rh123，為美國Sigma公司產品）；真龍牌香煙（廣西中煙工業有限責任公司出品，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量13 mg）；Trizol Reagent（invitrogen公司，貨號：15596-026）；逆轉錄試劑盒（Fermentas公司，貨號：00064525）；PCR試劑和Taq DNA聚合酶（Fermentas公司 美國）；氯仿、無水乙醇、異丙醇（上海中試化學試劑有限公司）；DEPC（Sigma公司）；引物及探針合成（invitrogen公司）；熒光定量試劑（TaKaRa公司）。

1.3分組、模型制作及給藥方法將動物隨機分為6組：即A組（正常對照組）、B組（COPD模型組）、C組（黃芪建中湯組高劑量組）、D組（黃芪建中湯組中劑量組）、E組（黃芪建中湯組低劑量組）、F組（金水寶膠囊組），每組20只。按照宋一平等[1]介紹的方法（香煙霧熏加LPS氣管滴入法）復制大鼠COPD模型，即制模開始后1 d和14 d向氣管內滴入LPS各1 g/L，2～13 d和15～60 d每日在80 cm×50 cm×40 cm密閉箱內香煙霧熏30 min（烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg），每次10支。黃芪建中湯常規煎法，并濃縮成相應濃度。給藥劑量分別為低劑量組2.8 g/kg/d，中劑量組5.6 g/kg/d，高劑量組11.2 g/kg/d（以上均為生藥量），分別相當于臨床用量的5、10、20倍，金水寶膠囊組給藥劑量為0.5 g/kg/d，相當于臨床用量的10倍，灌胃8周。

3討論

目前，從脾論治COPD的研究較為活躍，不僅有理論探討、臨床療效觀察，而且還涉及到作用機理方面的研究，機理研究方面已涉及到抗炎性介質、抗氧化、細胞免疫調節以及病理學的改變等內容。但綜觀目前的研究現狀，指標的相關性不夠明確，特異性不強，因此中醫作用機制及靶點所在尚不明確。眾所周知，線粒體是整個細胞乃至生命體進行各項生命功能活動的樞紐和核心，線粒體作為氧化磷酸化場所，主要功能是合成和利用ATP，為細胞生命活動提供能量。催化此能量偶聯反應的酶為F0F1-ATPase，它位于線粒體內膜的基質側，主要由F0和F1組成。ATPase 6、ATPase 8是F0F1-ATPase疏水部分F0的兩個亞基，由mtDNA ATPase6、ATPase8基因編碼。F0部分是鑲嵌在線粒體內膜的質子通道，當H+順濃度梯度經F0回流時F1催化ADP和Pi生成并釋放ATP[2]。ATPase6亞基在線粒體電子轉遞鏈的氧化磷酸化過程中起質子泵作用，而ATPase8亞基主要與ATP合成酶活性有關[3～4]。

本實驗中模型組大鼠mtDNA ATPase 6、ATPase 8熒光表達水平明顯下降，說明ATP酶合成減少，線粒體能量代謝障礙；而治療組相較于模型組熒光表達水平明顯升高，說明黃芪建中湯具有對抗內毒素和煙霧造成的ATPase 6、ATPase 8基因表達下調，提高ATPase活性，改善細胞能量供應而發揮其保護效應。

參考文獻：

[1]中華醫學會呼吸病學分會·慢性阻塞性肺疾病診治指南[J]·中華結核和呼吸雜志，2002，25：453-460.

[2]Ronnemaa T，KnipM，Lautala P，et al.Serum insulin and other cardio 2 vascular risk indicators in children，adolescents and young adults[J].AnnMed，199，l 23（1）：67-72.

[3]MustA，DallalGE，DietzWH.Reference data for obesity：85th and 95th percentiles of body mass index（wt/ht2）and triceps skinfold thickness[J].Am JClinNutr，1991，53（4）：839-846.

[4]BellizziMC，DietzWH.Workshop on childhood obesity：Summary of the discussion[J].Am JClinNutr，1999，70（1）：173-175.

（收稿日期：2014-03-07）endprint