安徽道地藥材斷血流的愈傷組織誘導條件研究

陳宇 王芳 李耀亭

摘要 [目的]研究不同基礎培養基及添加的植物生長調節劑濃度對斷血流愈傷組織的誘導效果。[方法]通過配制不同的培養基，選擇適宜誘導斷血流愈傷組織的培養基;然后選用適宜的培養基，研究不同濃度的6-BA及NAA對斷血流愈傷組織誘導的影響。[結果]MS、N6、B5、RM、Miller 5種基本培養基中，適合斷血流愈傷組織誘導的基本培養基為MS;研究不同的生長素NAA及細胞分裂素6-BA濃度時發現，NAA為0.1 mg/L和6-BA為1.0 mg/L時，斷血流組培效果較好。[結論]斷血流組培效果最好的培養基是MS培養基中NAA為0.1 mg/L和6-BA為1.0 mg/L。

關鍵詞 斷血流;培養基;植物生長調節劑;誘導;愈傷組織

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11667-02

Research on the Condition of Calls Induction of Genuine Clinopodii polycephali of Anhui

CHEN Yu1， WANG Fang1， LI Yao-ting2*

（1. Xishan Biotechnology Company Ltd of Luan， Luan， Anhui 237005; 2.Plant Cell Engineering of West Anhui University Engineering Research Center of Anhui， Luan， Anhui 237012）

Abstract [Objective] The research aimed to study the effect of the media types and the concentration of plant growth regulator on the callus induction of Clinopodii polycephali. [Method] Choose the suitable culture medium from the preparation of different kinds of medium. In the appropriate culture medium cases， the effect of the different concentration of 6-BA and NAA on inducing callus of Clinopodii polycephali were studied.[Result]MS was best to induce callus of Clinopodii polycephali among MS， N6， B5， RM， Miller.The research of the different concentrations of auxin NAA and cytokinin 6-BA found that when NAA was 0.1 mg/L and 6-BA was 1.0 mg/L， the effect on inducing callus of Clinopodii polycephali was better. [Conclusion]The best suitable medium was MS with NAA 0.1 mg/L and 6-BA 1.0 mg/L.

Key words Clinopodii polycephali;Medium; Plant growth regulator; Induction; Callus

基金項目 安徽省科技攻關計劃項目（12010402083）。

作者簡介 陳宇（1988- ），女，山東棗莊人，碩士，從事中藥材病蟲害防治研究。*通訊作者，工程師，博士，從事中藥材組培及栽培技術研究。

收稿日期 2014-10-15

斷血流是1970年從安徽民間發掘出來的止血藥，為皖西大別山道地中藥，是唇形科植物風輪菜Clinopodium chinensis或蔭風輪Clinopodium polycephalum的干燥地上部分;風輪菜載于1406年的《救荒本草》，蔭風輪載于1848年的《植物明實圖考》。風輪菜分布于浙江、江西、福建、廣東、廣西、貴州等地;蔭風輪主要分布于江蘇、安徽、廣西、貴州、云南、四川等地。皖西大別山斷血流年產量300 t左右，藥材微苦、味澀、辛涼，其功能為涼血止血。2005版藥典一部收載的斷血流即為上述2種原植物。臨床上應用于吐血、咯血、尿血、崩漏、外傷出血等[1-4]，用處較廣，市場潛力良好。筆者通過試驗研究不同的基礎培養基以及添加的植物生長調節劑濃度對斷血流愈傷組織的誘導效果，為進一步的誘導育種和斷血流皂苷A的工業化生物合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

六安霍山采集的斷血流。

1.2 培養條件

在無菌室內進行培養，培養溫度控制在（25±2）℃，光照強度 1 800～2 000 lx，每天光照 12 h。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同基本培養基對斷血流愈傷組織誘導的影響。

1.3.1.1 培養基的配制。

以MS、N6、B5、RM、Miller為基本的培養基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L、細胞分裂素6-BA（1.0 mg/L）和生長素NAA（0.1 mg/L）。將做好的培養基攪拌均勻，并用氫氧化鈉將pH調整至5.8～6.0。

1.3.1.2 培養基的滅菌。將配制好的培養基分裝到組培瓶中，用蓋子封好，分裝，封口、 標明培養基種類和日期，放入高壓滅菌鍋滅菌。

1.3.1.3 接種外植體。接種前，將斷血流幼嫩的莖尖先用洗衣粉水溶液浸泡5～10 min，再用自來水沖洗30 min。將試驗要用到的解剖刀、剪刀、鑷子、培養皿等先放入超凈工作臺上，打開紫外燈照射 20 min。20 min 后攜帶外植體進入無菌室，用75%的乙醇擦拭超凈工作臺面、雙手及接種工具。金屬接種工具每次使用前均要在酒精燈上灼燒滅菌。先用 75%的乙醇對嫩葉進行表面消毒，再用0.1% 的 HgCl2滅菌 5～8 min，用無菌水沖洗5次，在滅菌過程中要不斷搖晃試管，使其充分滅菌。如此重復進行 3 次滅菌，將已滅菌的斷血流幼嫩的莖尖，在無菌條件下切成5 mm×5 mm大小的方塊。分別接種到5種培養基上，每種培養基接種5瓶，每種培養基重復3次。

1.3.2 不同濃度的6-BA及NAA對斷血流愈傷組織誘導的影響。

1.3.2.1 培養基的配制。

以MS為基本的培養基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L、細胞分裂素6-BA和生長素NAA。將做好的培養基按照一定梯度加入激素攪拌均勻（表1），并用氫氧化鈉將pH調整至5.8～6.0。分裝，封口、標明濃度和日期。

1.3.2.2 培養基的滅菌。滅菌方法同“1.3.1.2”項的方法。

表1 以MS為基本培養基的不同激素濃度的培養基

1.3.2.3 接種外植體。

接種前的準備工作同“1.3.1.3”項，在超凈工作臺上，每個濃度的培養基接種 5 瓶，每瓶接種5個嫩莖小塊，接種后標明接種時間。每個濃度重復3次。

2 結果與分析

2.1 5種基本培養基對斷血流愈傷組織誘導的影響

從接種3周后不同基本培養基對斷血流愈傷組織誘導的影響（表2）可以看出，MS培養基中原球莖出現率顯著高于N6和B5培養基等，MS、N6、B5、RM培養基均能夠誘導斷血流原球莖外植體，但Miller基本培養基不能誘導斷血流外植體的出現。由此可見，適合斷血流愈傷組織誘導的基本培養基為MS。

表2 5種基本培養基對斷血流愈傷組織誘導的影響

2.2 不同濃度的6-BA及NAA對斷血流愈傷組織誘導的影響

從接種3周后不同濃度的6-BA及NAA對斷血流原球莖形成的結果（表3）可以看出，不同濃度的6-BA及NAA對斷血流形成原球莖的效果不同，培養基（1）和（2）上培養出的原球莖健壯度較好，且原球率的出現率較高，但比較而言培養基（1）誘導效果顯著好于培養基（2）;培養基（3）和（4）上培養出原球莖數量少，且健壯度差。

表3 6 種不同濃度培養基對斷血流愈傷組織誘導的影響

3 結論

斷血流的組織培養研究在我國目前沒有報道。該試驗在總結前人研究成果[5-6]的基礎上，研究了不同基本培養基和不同濃度的激素對斷血流組培的影響。試驗結果表明，培養基（1）即MS培養基中NAA 0.1 mg/L、6-BA 1.0 mg/L，在斷血流組培中作用最好。

該組培最好的培養基誘導愈傷組織原球莖出現率為52%，較低，是生長素濃度的影響還是其他因素的影響，還需要進一步的研究。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2005年版.一部[S].北京：化學工業出版社，2005：228-229.

[2] 馬亞紅，郭瑞清，韓麗峰.斷血流顆粒對藥物流產出血的影響[J].中國生育健康雜志，2006，16（3）：170-172.

[3] 李素紅，溫蘭英，張云，等.斷血流片治療功能性子宮出血49例[J].河南醫藥信息，2002，10（19）：45.

[4] 楊明英.斷血流顆粒預防上環術后月經過多100例[J].醫藥論壇雜志，2004，25（1）：36-38.

[5] 朱秀峰，楊蘭欽，張妙霞，等.唇形科若干香科植物組織培養[C]//陳振光.第二屆全國植物組織培養、脫毒快繁及工廠化生產學術研討會論文集.北京：中國農業科學技術出版社，2004.

[6] 趙銀河.鐵皮石斛愈傷組織誘導研究[J].種子，2012，31（12）：21-23.