白樺懸浮細胞蛋白質組學分析體系的構建

郭磊 詹亞光 范桂枝

摘要 [目的]建立一套適合白樺懸浮細胞蛋白質組學分析的雙向電泳體系。[方法]以白樺懸浮細胞為研究對象，采用改進的三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法提取懸浮細胞蛋白，使用17 cm、pH 4.0～7.0的IPG膠條，9.0 μg/μl的上樣量進行雙向電泳。[結果]可得到蛋白質點數目多、分辨率高和重復性好的雙向電泳圖譜。PDQuest軟件分析考馬斯亮藍染色后的凝膠，共得到約1 000個蛋白點。從這些蛋白點中隨機選取3個蛋白點經基質輔助激光解析電離飛行時間質譜 （MALDI-TOF MS） 分析后，搜索NCBInr 數據庫對蛋白進行鑒定。結果顯示，這3個蛋白分別為S-腺苷甲硫氨酸合成酶、transposase for IS1330和PadR家族轉錄調控蛋白。[結論] 為利用蛋白組學分析誘導子提高次生代謝物的積累機制奠定基礎。

關鍵詞 白樺;蛋白組學;懸浮細胞

中圖分類號 S188;Q943 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11638-03

Establishment of Proteomic Analysis of Suspension Cells in Betula platyphylla Suk.

GUO Lei， ZHAN Ya-guang， FAN Gui-zhi*

（College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin ，Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To establish a two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis （2-D PAGE） system for suspension cell proteomic analysis of Betula platyphylla.[Method]the improved acetic acid （TCA） -acetone precipitation method was applied for suspension cell protein isolation and purification， and the key technologies of electrophoresis including the sample loading quantity and types of IPG strip were optimized. [Reault]The results indicated that the reproducible 2-D gel with more spots and high resolution electrophoresis diagram could be obtained by using the improved TCA-acetone precipitation method， with 9.0 μg/μl of loading protein sample on 17 cm IPG strip with pH 4-7. About 1 000 protein spots were obtained by PDQuest software analysis. 3 randomly selected protein spots were used to identify by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry （MALDI TOF MS）. The identified 3 proteins were S-S-adenosylmethionine synthetase， transposase for IS1330 and transcriptional regulatory proteins of PadR family， respectively. [Conclusion] The study laid the foundation for using proteomics analysis inducer to improve secondary metabolites accumulation mechanism.

Key words Betula platyphylla Suk.; Proteomics; Suspension cell

基金項目 東北林業大學本科生創新項目“桑黃發酵產物中甾醇類物質的質量控制技術（20140225107）。

作者簡介 郭磊（1993- ），男，山西常治人，本科生，專業：生物技術。*通訊作者，副教授，博士，從事生物工程研究。

收稿日期 2014-10-20

近年來研究表明，白樺（Betula platyphylla Suk.）三萜具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降脂、利膽和保肝等作用，特別是白樺酯醇、白樺酯酸等三萜物質作為天然藥物在抗腫瘤和抗HIV等活性上顯示出與以往藥物不同的作用機制，靶向作用性更強，幾乎無不良反應等特點[1-3]。因此，白樺三萜作為藥物化學中的先導化合物而逐步受到研究者的注視。

前期研究表明，白樺酯醇和齊墩果酸等三萜物質可以在白樺愈傷組織和懸浮細胞中積累，但質量分數極低[4-5]。利用生物和非生物誘導子誘導白樺懸浮細胞，三萜含量明顯提高，但目前誘導子提高次生代謝物積累的原因尚不明確。

新興的學科蛋白組學為進一步揭示誘導子的作用機制提供了可能。蛋白質組學是從整體蛋白質水平上，在一個更加深入、更加貼近生命本質的層次上探討和發現生命活動的規律和重要生理、病理現象的本質[6-8]。目前，植物蛋白質組學研究技術已日漸成熟，然而，利用蛋白組學在誘導子提高藥用次生代謝物方面的研究報道卻很少，若能利用蛋白組學分析誘導子誘導次生代謝物的積累，將有助于從整體和動態的蛋白質水平了解次生代謝物的誘導積累機制。因此，筆者建立白樺懸浮細胞的蛋白質分析體系，以期為利用蛋白組學分析誘導子提高次生代謝物的積累機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白樺愈傷組織來自于白樺組培苗的莖段，篩選生長快、分散性好的白樺愈傷組織，將其繼代若干次后轉到液體培養基中懸浮培養。通過不斷選擇獲得分散性好的細胞懸浮物，經過6代以上的轉接，建立穩定的懸浮細胞系。

培養條件：固體培養基為NT培養基+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L TDZ，蔗糖20 g/L，瓊脂粉5.3 g/L，pH 5.6～5.8。液體培養成分同固體培養基，但不加瓊脂粉。培養基均以121 ℃高壓滅菌20 min，培養溫度為25～27 ℃，光照強度為2 000 lx，光照16 h/d，濕度為40%～50%，搖床轉速為120 r/min。

取培養9 d的白樺懸浮細胞，立即放于液氮中速凍，放于-80 ℃ 保存待用。

1.2 樣品的制備

取部分樣品液氮研磨，粉末加入PBS、1 mmol/L PMSF、0.01 g/ml DTT，4 ℃振蕩30 min;14 000 r/min 4 ℃ 離心30 min;上清加5倍體積的TCA-丙酮溶液，-20 ℃過夜沉淀;14 000 r/min 4 ℃ 離心30 min，去上清;加90%丙酮，14 000 r/min 4 ℃ 離心30 min，去上清，重復1次，室溫晾干沉淀;加適量裂解液回溶，bradford法測量濃度，-80 ℃ 保存。

1.3 雙向凝膠電泳

第1向等電聚焦凝膠電泳（IEF）采用17 cm，pH 3～10 IPG膠條，水化液組成為8 mol/L尿素，2%（質量分數）CHAPS，40 mmol/L DTT，0.6% （體積分數）Ampholyte （pH 3～10），0.002% （質量分數）溴酚藍。總上樣體積為500～800 μl，蛋白上樣量為8.8～9.4 μg/μl，水化和等電聚焦在20 ℃下進行。其程序為0～500 V，500 Vh;500 V，2 500 Vh;500～3 500 V，10 000 Vh;3 500 V，50 000 Vh;3 500～500V，8 000 Vh。等電聚焦后的IPG膠條在平衡緩沖液I（50 mmol/L Tris-HCl 6.8 ，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，2% DTT，0.02% 溴酚藍）中平衡15 min，然后在平衡緩沖液II（50 mmol/L Tris-HCl 6.8 ，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，2.5%IAA，0.02% 溴酚藍）中平衡5 min。將IPG膠條從樣品水化盤中移出，放到已配好的SDS-PAGE凝膠上端，并將marker放到凝膠的一端，再用0.5%的瓊脂糖將膠條和marker封嚴，切忌不能產生氣泡。并將膠板固定于電泳槽內。在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，進行考馬斯亮藍染色。

1.4 圖像采集與分析

凝膠用GS-800校準型光密度儀（Bio-rad）進行掃描采集，所獲得的凝膠圖像用PDQuest（Bio-Rad）軟件進行初步分析。

1.5 蛋白點的選取、酶解及質譜鑒定

從考染凝膠上隨機選取3個蛋白點并用槍頭切下后，用胰蛋白酶（Trypsin）進行酶解，肽段經MALDI-TOF MS 分析后得到肽質量指紋圖譜（PMF）數據，將這些數據遞交至MASCOT（http：//www.matrjxscience.corn）搜索引擎中，蛋白鑒定所使用的數據庫為NCBInr數據庫，主要參數設置與Yuan等的方法相同。

2 結果與分析

2.1 樣品制備

樣品制備是2-DE 成功與否的一個關鍵因素。對于木本植物白樺而言，次生代謝物如酚類、多糖等對蛋白質的提取影響很大。在參照木本植物TCA-丙酮提取方法的基礎上，主要對預處理時的低溫和細胞破碎方法進行調節，發現將懸浮細胞、研杵、研缽在-70 ℃低溫預冷8 h 以上，采用液氮加少許石英砂和PVP的方法，蛋白質的提取量由5.02 mg/ml上升到5.79 mg/ml，同時得到了高分辨率的圖片（圖1）。

2.2 IPG膠條pH范圍的確定

為進一步了解白樺懸浮細胞蛋白在2-DE圖譜上的分布， 在上樣量均為9.4 μg/μl 蛋白提取液的基礎上，使用2 種pH分別是4.0～7.0和3.0～10.0的17 cm 線性膠條，發現大部分蛋白點集中于pH 4.0～7.0，而在堿性端檢測到的蛋白較少（圖1A）。pH 4.0～7.0 的膠條提高了酸性蛋白在凝膠上的分辨率，蛋白點的分布較為均勻，且多數蛋白點呈圓形，邊界清晰。而pH 3.0～10.0膠條走出的蛋白點由于過于擁擠而呈雨點狀。因此，在17 cm膠條的情況下，分離白樺懸浮細胞蛋白質時應采用pH 4.0～7.0的膠條。

注：A. pH 4～7 ;B. pH 3～10。

圖1 不同pH梯度IPG膠條對蛋白質2-DE圖譜的影響

2.3 上樣量的確定

采用pH 4.0～7.0 的IPG線性膠條，分析8.8、9.0和9.4 μg/μl的上樣量對白樺懸浮細胞蛋白質雙向電泳分辨率的影響。結果表明，當上樣量為8.8 μg/μl 時，蛋白點雖然無拖尾現象，但點數明顯偏少，約900個點（圖2A）;上樣量為9.0 μg/μl 時， 檢測出的蛋白點數達到1 000多個，整個凝膠圖上的多數蛋白點呈圓形，邊界清晰，分布較均勻，一些低豐度蛋白清晰可見（圖2B）。上樣量為9.4 μg/μl 時，蛋白檢出率與上樣量為9.0 μg/μl時無明顯差別， 但一些高豐度蛋白在電泳過程中明顯影響其他蛋白質，分子量或等電點相近的蛋白點無法有效分開，部分蛋白點有較為明顯的拖尾（圖2C ）。因此，白樺懸浮細胞蛋白質雙向電泳上樣量為9.0 μg/μl 左右時，電泳圖譜效果較好。

2.4 蛋白點的等電點（pI）和分子量分析

對2次重復中可重復的917個蛋白點進行pI值（每0.5個pI范圍為1個區間）和分子量（每10 kD為1個區間）分布分析，發現917蛋白點pI值和分子量分布基本上呈正態分布趨勢（圖3）。其中，大部分蛋白點的都分布于pI 5.0～6.0和分子量20～70 kD。

2.5 蛋白點的質譜鑒定

從膠上隨機選取3個蛋白點進行MALDI-TOF MS分析，蛋白鑒定結果見表1。在鑒定的3個蛋白點中，沒有來源于白樺樹種的蛋白點，這3個蛋白點分別來源于Medicago sativa（紫花苜蓿）、Pectobacterium carotovorum subsp.、Lactobacillus jensenii（乳酸菌）物種，編碼S-adenosylmethionine synthase（S -腺苷甲硫氨酸合成酶）、transposase for IS1330、PadR family transcriptional regulator（PadR家族轉錄調控）蛋白。

注：A. 8.8 μg/μl;B. 9.0 μg/μl;C. 9.4 μg/μl。

圖2 不同上樣量下蛋白質2-DE 圖譜

圖3 蛋白點的等電點（pI）和分子量（MV）分布

表1 蛋白點的鑒定

3 結論與討論

在蛋白組學研究中，高質量的2-DE圖譜是蛋白質進行質譜分析的前提，為此在利用蛋白組學分析某一生物的生理功能時，需要建立該生物的蛋白組學分析體系。樣品制備是雙向電泳實驗中最基礎也是最關鍵的環節之一[9-10]。因白樺懸浮細胞中脂類、多糖等生物大分子以及鹽類小分子相對較少，且白樺細胞中蛋白的提取過程中沒有用到鹽溶液，因此白樺懸浮細胞樣品制備方法較固定，即參照木本植物TCA-丙酮提取法。利用該方法提取的蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，蛋白點呈圓形， 分離均勻，幾乎無橫條紋和拖尾現象，重復性高， 說明此方法適用于白樺懸浮細胞蛋白的提取。而且，在采用傳統TCA-丙酮提取法的基礎上，發現將懸浮細胞、研杵、研缽在-70 ℃低溫預冷8 h 以上，蛋白質的提取量由5.02 mg/ml上升到5.79 mg/ml。

蛋白質組是細胞內或組織中所有蛋白質總和，其中蛋白質數量巨大，蛋白質等電點也不同。為了最大限度地捕獲蛋白質信息量，首先用pH范圍較寬的IPG膠條（pH 3～10） 等電聚焦，然后根據雙向電泳圖譜上蛋白質點主要分布區域，選擇pH范圍相對較窄的IPG膠條，以增加相應區域蛋白點分辨率[11]。該試驗結果顯示，白樺懸浮細胞中的蛋白質大多在pH4～7的區域內，與pH 3～10 的IPG 膠條雙向電泳結果相比，蛋白質點分離效果好、數量較多。該類膠條能充分反映蛋白質組信息，為后續研究的深入開展創造條件。

另外，蛋白質上樣量是影響2-DE圖譜清晰度及蛋白質點多少的因素之一。上樣量過低，不利于檢測低豐度蛋白質，但上樣量過高又會導致蛋白質斑點過大，特別對于高豐度蛋白，嚴重影響其蛋白質組分的分離[12-13]。該試驗結果顯示，白樺懸浮細胞蛋白質雙向電泳上樣量為9.0 μg/μl 左右時，電泳圖譜效果較好。

該研究初步構建了白樺懸浮細胞的蛋白組學分析體系，確定了白樺懸浮細胞的蛋白質提取方法為TCA-丙酮提取法，并確定了IPG 膠條pH為4.0～7.0，最佳上樣量為9.0 μg/μl，并對分離出的3個蛋白點進行質譜分析，初步明確了被鑒定蛋白點的種類。該研究將為建立白樺的蛋白質組數據庫及確定各蛋白質的作用模式、功能機理、調節機制及蛋白質之間的相互作用，對于研究白樺的生長發育機理、環境脅迫、遺傳育種等具有重要的理論意義和實用價值。

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