水稻秸稈降解菌BCM9的分解特性及微生物群落動態研究

李雪 葛長明 李海粟 劉雙 陳迪 張本月 趙洪顏

摘要 [目的] 探索復合微生物菌系前處理秸稈生物質資源的潛能。[方法] 從沼液環境中篩選木質纖維素降解菌株BCM9，測定降解菌的分解特性和微生物群落的變化。[結果] BCM9的快速降解期是0～9 d；pH的變化是先降低后升高之后趨于穩定；在第9天時，揮發性脂肪酸濃度，木聚糖酶活和纖維素酶活值最高，乳酸0.291 mg/L，甲酸0.31 mg/L，乙酸1.93 mg/L，丙酸0.73 mg/L，木聚糖酶活1.79 U/ml，纖維素酶活0.37 U/ml；微生物群落的多樣性也最豐富，屬于Clostridium sp.、Bacillus sp.、Geobacillus sp.。[結論] BCM9降解水稻秸稈的快速穩定的降解期是第9天。

關鍵詞 水稻秸稈；微生物群落；揮發性有機酸

中圖分類號 S181.3；X172 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）31-11052-03

The Dynamic of Microbial Community and Degradation Characteristics of Rice Straw by BCM9

LI Xue， GE Changming+， LI Haisu， ZHAO Hongyan* et al

（Agricultural College of Yanbian University， Yanji， Jilin 133002）

Abstract [Objective] To evaluate the potential utility of pretreatment of raw biomass with a complex microbial system. [Method] Lignocellulose was selected from biogas slurry environment to degrade strain BCM9， the degradation properties of the bacteria and microbial community change was determined. The degradation characteristics and corresponding changes in the bacterial community were assessed. [Result] The results showed that rapid degradation occurred from day 0 to day 9. The pH of the fermentation broth initially declined and then increased， and the mass of rice straw steadily decreased. The highest concentrations of volatile fatty acid contents （0.291 mg/L lactic acid， 0.31 mg/L formic acid， 1.93 mg/L acetic acid， and 0.73 mg/L propionic acid） as well as the highest xylanse activity （1.79 U/ml） and carboxymethyl cellulase activity （0.37 U/ml） occurred on day 9. The greatest diversity among the microbial community also occurred on day 9， with the presence of bacteria belonging to Clostridium sp.， Bacillus sp.， and Geobacillus sp. [Conclusion] BMC9 has a strong ability to rapidly degrade the lignocelluloses of rice straw under relatively inexpensive conditions， and the optimum fermentation time is 9 days.

Key words Rice straw； Microbial community； Volatile fatty acids

木質纖維素是地球上最為豐富的生物資源，約占植物總干重的1/3～1/2，它能夠被微生物降解^[1]。秸稈是籽粒收獲后耕地上重要的農業廢棄物資源，吉林省每年有超過0.6億t的秸稈廢棄物資源。由于秸稈等農業廢棄物資源在自然狀態下極難分解，只能就地丟棄或焚燒，不能歸還土壤。大量待分解的秸稈不僅占用耕地還限制營養元素歸還土壤，而且焚燒產生的煙塵影響生態環境和人類健康。因此，如何將秸稈變廢為寶是實現環境保護和農業可持續發展的重要課題^[2]。

崔宗均等突破傳統的微生物純培養分離方法，在不破壞自然界中微生物之間協同關系的前提下，將酸堿反應不同的菌群優化組合，篩選和馴化了高效而穩定的纖維素分解復合菌系MC1、XCD2、WDC2等復合系[1，3-4]。此復合系的降解能力遠遠高于純培養的單個菌株，在8 d內可完全降解水稻秸稈^[5]。而且這些復合系對在厭氧發酵產甲烷過程中有顯著的優勢，但是這些復合系都是從畜禽糞便堆肥環境中篩選出來的。因此，該研究是從沼液厭氧環境中篩選出BCM9復合系，為秸稈厭氧發酵產沼氣的酸化處理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以筆者實驗室構建的木質纖維素分解復合菌系BCM9作為菌種，培養基為蛋白胨纖維素培養液（PCS），其成分為5 g蛋白胨，5 g NaCl，2 g CaCO3，1 g 酵母粉及1 L的去離子水。配制800 ml PCS培養基于1 L的三角瓶中，添加8 g水稻秸稈，121 ℃滅菌15 min。水稻秸稈經1.5%NaOH堿液浸泡48 h后，用自來水沖洗到pH為7.0左右，105 ℃烘干后，將其剪到合適的長度以便放入300 ml的三角瓶中。調節pH試驗中，需配制1%、2%、3%NaOH溶液用于調節培養液的pH。更換培養基試驗中需配制新鮮的PCS培養基。

1.2 培養條件

每個300 ml的三角瓶中裝入238 ml PCS培養基，稻稈的添加量分別為培養基體積的5%（W/V）。培養基在121 ℃下滅菌15 min后備用。將培養3 d的BCM9菌種按照5%體積的接種量接種到新鮮培養基中，60 ℃下靜置培養。

1.3 水稻秸稈分解過程中pH的測定

pH的測定方法：取0.2 ml培養液，滴于HORIBA微型pH計（model B212，HORIBA，Japan）中進行測定。

1.4 BCM9分解后秸稈各成分測定

將烘干后的秸稈殘渣粉碎并過1 mm的篩子，稱取0.5 g裝入濾袋，3個重復，按照ANKOM220纖維分析儀操作規程及技術資料測定秸稈的纖維素、半纖維素、木質素含量。

1.5 BCM9發酵液中有機酸含量測定

發酵液樣品經8 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm 濾膜，在-40 ℃冰凍下保存，待樣品收集全后，用島津QP2010 型氣相色譜-質譜（GCMS）測定，測定分析柱為CPChirasilDex CB（25 m ×0.25 mm）毛細管柱；柱箱溫度50 ℃（1 min）→100 ℃（1 min），7 ℃/ min →195 ℃（2 min），18 ℃/ min，共14 min；進樣口溫度190 ℃；檢測器溫度200 ℃；載氣He（60 kPa），流量34 ml/min；分流比1/22；監測器電壓115 kV；進樣量1 μl。對測定的數據，利用NIST 數據庫進行定性分析。根據出峰物的定性分析結果，配制相應標準樣品的稀釋液作為標準物進樣，用于該物質的定量分析^[4]。

1.6 纖維素酶和木聚糖酶活力的測定

纖維素酶活力測定和木聚糖酶活力測定參見^[2-3]等方法。其中纖維素酶活力單位定義為：酶液在1 min內消耗纖維素產生1 mmol葡萄糖作為1 U；木聚糖酶活力單位（IU）定義為1 min水解木聚糖底物生成1 μg木糖所需的酶量為1個酶活力單位。

1.7 微生物動態群落動態分析

培養液經8 000 r/min離心15 min，棄上清收集菌體細胞，按照Benzyl chloride方法^[6]提取微生物的總DNA。16S rDNA的PCR擴增使用AmpliTaq GoldTM（Perkin Elmer，Japan），引物為357FGC（GC clamp5′CCTACGGGAGGCAGCAG3′）和517R（5′GTGCCAGC（A/C）GCCGCGG3′）。用PCR擴增產物進行DGGE分析^[7-8]。從膠上回收DNA條帶，測定其序列，GenBank數據庫檢索，進行相似性分析。

2 結果與分析

2.1 水稻秸稈降解過程中pH的變化

據報道，纖維素降解pH范圍為5.9～8.5^[6]。由圖1可知，水稻秸稈降解過程中2 d內發酵液的pH迅速地從7.4下降到6.2，隨著培養時間的增加，pH逐漸上升，第12天時達到8.3。

2.2 BCM9分解后秸稈各成分測定結果

由圖2可知，水稻秸稈的生物量總干重12 d后下降了75%。纖維素、半纖維素和木質素組成成分的質量分別降低了97.11%、74.70%和48.00%。前期研究報道的MC1的降解率為：生物量總干重減少81%，纖維素含量減少99%，半纖維素減少74%，木質素減少24%。比較表明，BMC9和MC1對水稻秸稈的木質纖維素具有很強的分解能力。這為BMC9降解木質纖維素沼氣發酵酸化階段的機制研究提供了理論基礎。

2.3 纖維素酶和木聚糖酶活力的測定結果

為檢測BMC9對水稻秸稈的降解能力，測定了12 d內纖維素酶活性和木聚糖酶活性的變化。結果表明，木聚糖酶的活性逐漸上升，在第9天時呈現峰值，為1.79 U/ml。纖維素酶活性在第9天達到最大值，0.37 U/ml（圖3）。酶活性的分析表明，BMC9對水稻秸稈分解能力最強的是在第9天。

它能夠降解木質素生產生物表面劑，促進難降解有機物的微生物分解，提高堆肥效率，縮短堆肥周期。條帶2、3、4、5、6、7、9、10、11、13、14、16是Clostridium sp.，據報道在堆肥環境中導致堆體溫度的快速上升，并具備能力降解纖維素^[3]。

3 結論

（1）水稻秸稈降解菌在降解過程中，發酵液pH先降低后升高，趨于穩定。

（2）降解后水稻秸稈的總生物量降低了75%，纖維素降低了97.11%，半纖維素降低了74.70%，木質素降低了48.00%。

（3）降解過程中揮發性脂肪酸、木聚糖酶活、纖維素酶活在第9天時數值最高。

（4）第9天時，發酵液中細菌微生物群落最為豐富，分別是Bacillus sp.、Clostridium sp.和Geobacillus sp.屬菌株。

參考文獻

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