毛白楊（BJHR01）磷酸肌醇特異性磷脂酶C（PLC2）基因生物信息學分析

李墨野 趙慧 姜洋 劉笑平 林永紅 李開隆

摘要 [目的]用生物信息學手段分析、預測毛白楊PLC2基因/蛋白質的結構與特征，為該基因的克隆及功能研究提供理論參考。[方法]以PLC2基因及對應蛋白質為研究對象，利用各種網上數據庫及生物信息學分析軟件對其進行相關分析、預測。[結果]PLC2基因的GenBank登錄號為JX424764.1，ORF長957bp，編碼318個氨基酸，對應蛋白質PLC2的分子量35 999.1D，理論等電點7.07；PLC2與毛果楊（XP_002313726.1）的同源性較高；PLC2屬于PIPLCc_GDPD_SF超家族，無O糖基化位點，無二硫鍵，無跨膜區和信號肽，有16個磷酸化位點。[結論]對PLC2基因/蛋白的各級結構及功能進行預測，為下一步試驗奠定基礎。

關鍵詞 毛白楊；磷酸肌醇特異性磷脂酶C；生物信息學

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）31-10867-06

Bioinformatics Analysis of Populus tomentosa cultivar BJHR01 Phosphoinositidespecific phospholipase C （PLC2） Gene

LI Moye， ZHAO Hui， JIANG Yang， LI Kailong et al

（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To analyze and predict the structure and feature of Populus tomentosa PLC2 gene/protein through bioinformatics method， and provide theoretical foundation for gene cloning and function research. [Method] Utilize various online databases and bioinformatics software to predict PLC2 gene and its corresponding protein. [Result] The GenBank accession number of PLC2 is JX424764.1， ORF is 957bp in length， encoding 318aa； the molecular weight of PLC2 is 35 999.1D， theoretical isoelectric point is 7.07； PLC2 has a higher homology with XP_002313726.1， belonging to PIPLCc_GDPD_SF superfamily， has no Oglycosylation site， no disulfide bond， no transmembrane domain or signal peptide， but 16 phosphorylation sites. [Conclusion] This study has predicted the structure and function of PLC2 gene/protein and paved the way for the following experiments.

Key words Populus tomentosa； Phosphoinositidespecific phospholipase C； Bioinformatics

毛白楊（Populus tomentosa）是以黃河中、下游流域為中心而廣泛分布的楊柳科落葉喬木，該樹種適應能力較強，是速生用材林，為防護林和行道河渠綠化的理想選擇^[1]。磷酸肌醇特異性磷脂酶C是真核生物胞內酶，在細胞信號轉導過程中起著重要作用^[2]。它能催化1磷脂酶D肌醇肌糖4，5二磷酸水解成第二信使物質甘油二脂、肌糖1，4，5三磷酸的反應，這個催化作用還受到可逆磷酸化反應以及調節蛋白質的調控^[3-5]。筆者通過生物信息學手段對毛白楊（BJHR01種）磷酸肌醇特異性磷脂酶C（phosphoinositidespecific phospholipase C，PLC2）基因的核酸/蛋白質序列的分子特征、一級結構、二級結構以及三維結構進行了預測，并對該蛋白進行了系統進化分析，從而為下一步的分子生物學試驗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

所選材料為毛白楊（BJHR01種）磷酸肌醇特異性磷脂酶C基因，GenBank登錄號：JX424764.1。

1.2 方法

利用BioEditClustalW軟件對11個物種的磷酸肌醇特異性磷脂酶氨基酸序列進行多序列比對；應用MEGA5軟件構建系統進化樹；利用ExPASy中的ProtParam工具（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）對蛋白質的理化性質進行在線分析；通過NetOGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）進行糖基化位點的預測；通過NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對PLC 2的磷酸化位點進行預測；利用在線工具COILS預測PLC2的卷曲螺旋結構；利用PredictProtein和psipred預測PLC2蛋白的二級結構；利用PROSITE（http：//prosite.expasy.org/）確定出PLC 2的活性部位；利用在線工具PredictProtein（http：//www.Predictprotein.org/）和 TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）方法預測PLC2氨基酸序列可能的跨膜區；應用SignalP在線預測毛白楊磷酸肌醇特異性磷脂酶C的信號肽；利用SWISS MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）預測PLC2蛋白質的三級結構；用Raswin和spdbiew軟件查看三級結構預測結果。

2 結果與分析

2.1 PLC2基因及相應氨基酸序列的一級結構

2.1.1 plc2基因的開放讀碼框及翻譯。

首先檢索NCBI中的GenBank獲得PLC2基因的完整cds，再利用ORF Finder查找其開放讀碼框，獲得一條長957 bp的完整ORF，利用SMS在線翻譯（+1框）該核酸序列，結果見圖1。

2.1.2 plc2基因的染色體定位。

利用NCBI中的工具MapViewer初步檢索毛果楊基因組，使用普通檢索和高級檢索，均未找到與之匹配的結果。于JGI數據庫進行BLAT Search，結果發現在毛果楊的第9號和第4號染色體上的得分最高，分別為1 583.0、1 825.0，相似程度分別為90.6%、98.7%（圖2）。由于毛果楊與毛白楊親緣關系較近，因此推測PLC2基因可能位于毛白楊栽培種BJHR01的第4或第9號染色體上。

2.1.3 氨基酸序列分析。

經過ExPASy在線軟件分析，得出PLC2氨基酸數目為318，相對分子質量為35 999.1 D，理論等電點（pI）為7.07。在PLC2中，亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）和纈氨酸（Val）3種氨基酸含量最高，均為7.5%。甲硫氨酸含量最低（Met），僅為1.3%（圖3）。PLC2蛋白原子組成為C∶H∶N∶O∶S=1 603∶2 530∶440∶478∶12，即分子式為C1603H2530N440O478S12，原子總數為5 063。不穩定系數為38.26。

2.1.4 PLC2的親疏水性分析。

利用ProtScale軟件繪制毛白楊磷酸肌醇特異性磷脂酶C親疏水性列譜，以預測其折疊情況。使用Hphob./Kyte&Doolittle算法進行預測，見圖4。結果發現，該蛋白質僅存在1個高分值峰（Score>1.5），分布在第300～310位殘基之間；而3個低分值（Score<0）的峰分別位于第40～50、150～160、190～200氨基酸殘基位點附近，可初步推測這3個位置為蛋白質的卷曲結構部位。

3 討論

該研究通過生物信息學的方法對PLC2基因的DNA序列、蛋白質序列進行了分析，并預測了相應蛋白質的結構與功能。利用PROSITE預測出該蛋白的保守結構域為PIPLC_X_DOMAIN，位于第57～185位氨基酸殘基之間，其中以2個組氨酸（H）為活性中心位點，即為該酶的催化活性中心。序列比對表明，PLC2的PIPLC_X_DOMAIN結構域在不同物種中具有很高的保守型。蛋白質的結構分析顯示該酶無卷曲結構，無二硫鍵，無明顯的跨膜區，且未預測出信號肽。筆者還利用SWISS MODEL（Automated Mode）預測了PLC2的三維構型，結果表明，QMEAN Z-Score=-6.19，與模板蛋白序列比對的一致性也非常低（14.92%），說明預測結果可信度不高，原因可能是該蛋白質本身不穩定或是所選靶標蛋白不當，下一步通過Robetta BETA從頭預測PLC2蛋白的三級結構。

另外，筆者通過研究發現，使用不同的分析工具對同一條序列進行分析，可能會得到不同的結果，這可能是因為不同的軟件所應用的計算方法各異。因此，該研究對PLC2/PLC2的所有預測結果僅能作為參考，具體功能研究還需要經過大量嚴謹的試驗進行驗證。

參考文獻

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