一株抗生素制藥工業廢水高效降解菌篩選及生物特性研究

王俊峰 尹堯 陳玉花 加春生 王曉楠

摘要 [目的] 從抗生素廢水處理的活性污泥中篩選出具有高效降解能力的菌株。[方法]從抗生素制藥工業廢水處理的活性污泥中分離到1株抗生素高效降解菌NG3，對其進行形態學、生理生化鑒定和16SrDNA序列比對分析，同時對該菌株的生物學特性進行初步研究。[結果]從抗生素制藥工業廢水處理的活性污泥中分離得到1株抗生素高效降解菌NG3，經形態學、生理生化鑒定和16SrDNA序列比對分析，確定該菌株屬于不動桿菌屬（Acinetobacter sp.），命名為Acinetobacter sp.NG3。[結論] 為抗生素類工業廢水高效處理提供借鑒。

關鍵詞 抗生素； 16SrDNA ；Acinetobacter；降解菌

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）31-10851-02

Screening and Its Degrading Properties of Effective Degradation Strains for Antibiotic Production Wastewater Treatment

WANG Junfeng1 ，YIN Yao2， CHEN Yuhua1 et al

（1.Heilongjiang Agricultural Engineering Vocational College， Harbin，Heilongjiang 150088； 2.Harbin Pharmaceutical Group biovaccine Co. Ltd， Harbin，Heilongjiang 150025 ）

Abstract [Objective] The aim was to screen effective degradation strains from activated sludge treatment of antibiotic wastewater. [Method] Through selective enrichment culture a effective degradation strains NG3 was isolated from antibiotic production wastewater treatment， physicbiochemical identification and phylogenetical analysis of 16S rDNA sequence were carried out.[Result] Through selective enrichment culture a effective degradation strains NG3 was isolated from antibiotic production wastewater treatment. Based on the results of physicbiochemical identification and phylogenetical analysis of 16S rDNA sequence，the strain was belonged to Acinetobacter，named as Acinetobacter sp.NG3.[Conclusion] The study provided reference for effective treatment of industrial waste for antibiotic.

Key words Antibiotics ；16S rDNA； Acinetobacter； Aiodegradation

近年來，隨著抗生素制藥工業的快速發展，抗生素工業廢水已成為嚴重危害人類健康和生態環境平衡的棘手問題，對抗生素制藥工業廢水進行有效處理已經刻不容緩，成為制約社會可持續發展的緊要問題^[1]。抗生素生產過程中產生大量的發酵液、酸廢水、堿廢水和有機溶劑廢水等。其具有有機物濃度高、存在生物毒性物質、色度高、氣味重、pH波動大等特征^[2]。目前，抗生素制約工業廢水處理方法主要有化學處理法、物化處理法（包括混凝-沉淀法、反滲透-膜分離法、吸附法、光降解法、包埋法及電解法等）、生物處理法以及多種方法復合處理等。其中生物處理方法具有處理條件較為溫和、微生物適應性較強、費用低廉、較易培養等優點，現已廣泛應用于抗生素制藥工業廢水的處理^[3]。筆者試圖從抗生素廢水處理的活性污泥中篩選出具有高效降解能力的菌株，并研究其生物降解特性，應用于實際生產，以期為抗生素類工業廢水高效處理提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 水樣 試驗水樣取自哈爾濱某制藥企業廢水排放口，活性污泥取自曝氣池的回流污泥。

1.2 培養基

①無機鹽培養基：KH2PO4 0.9 g/L，Na2HPO4·12H2O 6.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，（NH4）2SO4 0.4 g/L，微量元素1 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。②LB培養基：蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，固體培養基中瓊脂含量為1.5%。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效降解菌株的分離篩選。

（1）增殖培養：取2 ml活性污泥沉淀的上清液，接種到裝液量200 ml的三角瓶中，于30 ℃、100 r/min下培養48 h，而后進行瓊脂平板劃線分離，分離得到的單菌落經多次反復分離、純化后得到純菌株^[4]。

（2）菌株篩選：將分離純化得到的菌落特征較典型、性狀較優良的純菌株分別接種到含50%廢水的無機鹽培養基中，于30 ℃、100 r/min條件下培養48 h，根據菌體的生長情況和對COD的去除率，篩選出降解率高的優勢菌株^[5-6]。

1.3.2 菌株的鑒定。

（1）形態、培養及生理生化特征鑒定。對純培養菌株的菌落特征、培養特征和生理生化特征進行觀察與鑒定，同時采用透射電鏡進行觀察^[7]。

（2）16SrDNA序列分析法鑒定。以細菌總DNA為模板，選取一對細菌通用引物進行擴增，其核酸序列如下：引物BSF8/20：5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3（E.coli16s rDNA對應位點為8～27）；引物BSR1541＼20：5AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3（E.coli的16s rDNA對應位點為1541～1522）。PCR反應條件：94 ℃變性1min，55 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，在此條件下進行30個循環，然后在72 ℃下保溫10 min，測序由大連寶生物工程有限公司完成。將菌株NG3 16s rDNA核酸序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據庫進行比對分析（http：//ncbi.nlm.nih.gov＼blast），由GenBank中得到相關菌株的序列，與該研究所測的序列一起輸入Clustalx1.8程序進行DNA同源性序列分析^[8]。

1.3.3 生物量與COD測定。生物量用光密度OD600表示，COD的測定用重鉻酸鉀法^[9]。

1.3.4 NG3菌株的生長及降解特性。

采用正交試驗法研究高效降解菌NG3菌株的生長及降解特性^[10]。其正交試驗的因素與水平見表1。

2.2.2 NG3菌株核酸序列同源性比較。

將NG3菌株16SrDNA測序結果輸入GenBank中，利用Blast軟件進行序列同源性分析，結果表明，NG3與Acinetobacter（不動桿菌屬）的大多數菌種的相似度達到95%以上，其中NG3與菌種Acinetobacter sp.C65的16S rDNA序列相似度達到99%。

3 結論

該試驗通過選擇性富集培養，從高濃度抗生素制藥工業廢水處理的活性污泥中篩選得到一株具有較高抗生素降解能力的優勢降解菌NG3，經染色觀察、形態特征、培養特征及

生理生化特征鑒定和16SrDNA序列分析，最終確定NG3菌株為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）。進一步的降解研究表明，Acinetobacter sp.NG3菌株的降解作用受溫度影響較敏感，可能是溫度影響NG3菌分泌的降解抗生素的代謝酶的活性，其次是轉速，通過搖瓶發酵試驗表明，轉速大小直接影響氧氣的供應，pH影響最小。最終確定其最佳降解條件為：溫度為35 ℃，搖床轉速為150 r/min，初始pH為7.0。Acinetobacter sp.NG3菌株是從自然環境中篩選獲得的野生型菌株，經發酵優化后其COD去除率達到89.5%，作為工業化大規模處理抗生素制藥廢水并不一定理想，但可作為出發菌株，通過人工誘變育種的方法篩選COD去除率較高的優勢菌株；也可以對其進行基因克隆，利用基因工程的方法構建工程菌，以適合大規模工業化進行抗生素制藥廢水處理的需要。

參考文獻

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