間充質干細胞增殖的研究進展

史恒瑞 董平

【摘要】間充質干細胞屬于多潛能干細胞，其多向分化的能力在臨床治療中有廣泛的應用價值。但通過目前的研究發現，間充質干細胞在增殖過程中存在著隨著體外培養時間增加增殖潛力和多向分化潛力逐漸喪失的問題。因此，如何使間充質干細胞在體外培養時可以穩定地增殖逐漸成為研究的熱點。下面從目前常見的幾種間充質干細胞增殖的方法就間充質干細胞增殖的研究進展作一綜述。

【關鍵詞】間充質干細胞 增殖

【中圖分類號】R-1 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)07-0605-01

間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）是干細胞的一個分支，其來源于發育早期的中胚層和外胚層，系多潛能干細胞，其主要存在于結締組織及器官間質中，尤以骨髓中含量最為豐富，在體內或體外特定的誘導條件下，可以分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，這種多向分化潛能和極強的可塑性使其在組織工程、基因治療和免疫治療方面有著巨大的應用前景。但人體內的間充質干細胞畢竟有限，且MSC在體外傳代、增殖過程中存在著增殖能力和多向分化能力逐漸喪失的問題［6-9］，無法完全滿足臨床治療的需要，所以，如何獲得量大質優的間充質干細胞就成為其成功應用于臨床治療的瓶頸。本文就不同來源的間充質干細胞促增殖方法的角度就間充質干細胞增殖的研究進展做一綜述。

1人羊膜間充質干細胞

人羊膜是來源于胎兒的胚胎早期產物，位于胎盤的最內層，厚約0.02-0.05毫米，其透明、韌性佳，無血管、神經和淋巴管等組織，組織結構分為上皮層、基底膜層、致密層、纖維母細胞層及海綿層，隨孕婦分娩排出體外，是生產的廢棄物。人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）即存在于人羊膜中，具有獲取相對簡單、不增加額外創傷、幾乎不受倫理學限制、來源豐富、免疫原性低、增殖能力強及多向分化潛能等優勢［1］，有望成為組織工程中理想的種子細胞。但人羊膜間充質干細胞同樣存在著缺陷，其在體外傳代、增殖過程中會逐漸喪失其自我增殖能力及多向分化潛能。為此，張一折等［2］將β-catenin-綠色熒光蛋白重組腺病毒擴增后，轉染人羊膜間充干細胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效率并采用CCK-8法測定細胞的生長狀況，結果發現β-catenin-綠色熒光蛋白在細胞中高表達，且由于β-catenin的高表達刺激了人羊膜間充質干細胞的增殖。此外，李彩虹等［3］將人羊膜間充質干細胞培養至第三代，經過不同濃度的表皮生長因子處理后采用MTT法測量細胞的存活率，通過計數穿過transwell小室的細胞數測定表皮生長因子對細胞遷徙能力的影響，并用表皮生長因子受體的抑制劑AG1478及P13K的抑制劑LY294002檢測其對細胞遷徙能力的影響，結果發現表皮生長因子處理后的細胞增殖和遷徙能力均得到一定程度上的增加，為人羊膜間充質干細胞更好地治療皮膚創傷及傷口愈合提供了實驗依據。王兆福等［4］發現將兩個個體來源的人羊膜間充質干細胞混合培養后增殖情況高于單獨培養的細胞，但未做更深入的研究。陳亭等［5］將人羊膜間充質干細胞分別置于體積分數為5﹪02和20﹪02條件下培養并做成骨誘導，觀察細胞在不同氧濃度下生長情況及成骨分化情況，得出結論：與常氧組相比，低氧更能促進人羊膜間充質干細胞的增殖及成骨分化.并大膽推測這可能是由于低氧情況下細胞產生的乳酸明顯減少所導致的。周倩等［10］將人羊膜間充質干細胞分別在孔板靜態及微載體動態培養條件下擴增及成骨誘導，發現在微載體動態誘導培養條件下可獲得較高的細胞數和較好的成骨誘導分化效果，提高了堿性磷酸酶活性與鈣基質含量，流體刺激與包被的I型膠原均可促進人羊膜間充質干細胞的成骨分化，且兩者聯合應用時促進作用更明顯。因此，基于微載體的動態培養體系可以促進間充質干細胞在骨組織再生工程中的應用。

2骨髓間充質干細胞

骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem ceils，BMSCs)不僅具有干細胞多向分化潛能，還具有低免疫源性、易于獲取等特點，并易于外源基因的轉染和表達，因此，它已成為細胞治療和基因治療等領域中能有效發揮作用的理想工程細胞［11］。但是骨髓中BMSCs含量極其稀少，BMSCs在體外增殖亦較慢，而且隨著傳代次數的增加，細胞表型就會逐漸喪失［12-13］。因此，如何實現少量取樣且大批量獲取是BMSCs滿足臨床實驗研究的當務之急。為此，劉紅等［14］ 運用siRNA干擾技術沉默低氧誘導因子-1α 基因，將細胞分成6組，分別采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細胞儀和乳酸脫氫酶(1actic acid dehydrogenase，LDH)活力測定等方法，檢測各組BMSCs的增殖、凋亡和壞死情況；Western blot和real-time PCR檢測各組BMSCs中HIF-1α 、葡萄糖轉運子-1(glucose transporter，GLUT-1)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的mRNA和蛋白的表達，得出結論：低氧預處理可促進BMSCs的體外增殖，減輕壞死，其機制可能與低氧預處理后HIF-1α 表達增加及上調其下游基因GLUT-1和VEGF表達有關。王立維等［15］通過研究得出了與上述實驗相似的結論：大鼠骨髓間充質干細胞移植在低氧(體積分數1%O2)下增殖和遷移能力增強。另外，任立杰等［16］為尋求能在體外快速、大量的增殖骨髓間充質干細胞，采用了鋅及堿性成纖維細胞生長因子單獨或聯合加入到培養基中，觀察細胞生長狀況，結果證實，鋅和堿性成纖維因子均有促進體外培養的骨髓間充質干細胞增殖的作用，聯合應用鋅和堿性成纖維細胞生長因子促增殖作用最強，而且可以保持骨髓間充質干細胞的生物學活性，可以作為體外擴增培養骨髓，基質細胞的最佳培養條件。有研究表明［22］：改良富血小板血漿對人骨髓間充質干細胞增殖的促進作用具有濃度依賴性，且10%改良富血小板血漿可以較好地保持人骨髓間充質干細胞的免疫原性。隨著中藥學的發展，其獨特的藥理學作用也越來越受到人們的關注，王明寧等［17］利用香丹注射液促進了大鼠骨髓間充質干細胞的增殖，這個發現也為科研人員開辟了新的思路。繼王明寧之后，陸續有報道稱淫羊藿苷［18］、麝香酮［19］、獨參湯［20］、復方接骨中藥［21］均對骨髓間充質干細胞有促增值的作用。

3臍血間充質干細胞

臍血是嬰兒出生后，留在胎盤和臍帶中的血液，臍血中含有大量的造血干細胞，同時還含有豐富的造血基質細胞（基質細胞泛指間充質來源的非造血干細胞）。基質細胞是造血干細胞賴以生存的微環境，在造血調控中發揮重要的作用。臍血間充質干細胞即是其中的一種，它具有不同于造血干細胞的生物學特性。臍血間充質干細胞與骨髓間充質干細胞相比，具有一些特殊的優勢：臍血來源最廣泛，對供者最安全。 采集臍血對產婦和新生兒均無任何不良影響。有研究表明［23］：臍血干細胞端粒和端粒酶活性均長于和高于骨髓中的干祖細胞,因此移植后的壽命更長，可以更持久地維持機能。Terai等［24］發現臍血干細胞通過轉染攜帶人端粒酶逆轉錄酶的逆轉錄病毒以延長壽命。臍血間充質干細胞為較原始的間充質干細胞，具有更強的增殖、分化能力；而且細胞的未發育成熟，特別是免疫重建后T細胞的功能較弱，因此引起的移植物抗宿主病較弱［25］。盡管臍血間充質干細胞擁有如此多的優點，但在實驗中發現：臍血間充質干細胞的分離培養成功率較低，如何提高臍血間充質干細胞的貼壁粘附及生長需要進一步的探索。杜江榕等［26］發現：在培養基中加入5-100ng/ml的表皮生長因子（EGF）對臍血間充質干細胞具有促增殖的效應，且作用強度呈劑量依賴性。另有報道［27］稱：在培養基中添加0.15g/L的還原性谷胱苷肽可以明顯促進臍血間充質干細胞的增殖，并且在增殖的同時不影響臍血間充質干細胞的表面標志分子CD29/CD44/CD45等，通過此法有望為復雜疾病的干細胞治療提供足量的細胞。顏小華等［28］通過控制變量、分組培養后發現：黃岑苷體可有效促進人臍血單個核細胞的增殖，并推測可能與在一定程度上激活即刻早期基因核轉錄因子K+B，進而促使細胞提高分泌白細胞介素6水平有關。王哲等［29］報道：在每升培養基中加入10、20、50、100微摩爾普羅布考可促進細胞的增殖，降低細胞ROS含量，增加SOD和GSH-Px活性。

鄭穎娟等［30］ 體外培養臍帶間充質干細胞，經重組腺相關病毒作為載體介導堿性成纖維細胞生長因子基因轉染，分組培養后，通過檢測發現轉染堿性成纖維細胞生長因子后細胞的生長速度明顯增快，細胞周期G0/G1 期減少，S 期細胞數增多，說明通過重組腺相關病毒作為載體介導堿性成纖維細胞生長因子基因轉染能促進體外培養的臍帶間充質干細胞增殖，對其培養有優化作用。除在培養基中添加額外成份外，有學者則將研究重點放在了培養細胞的大環境上，據文獻［31］報道：恒磁場對人臍血間充質干細胞增殖的影響與磁感應強度有關,0.05mT的磁場促進間充質干細胞的增殖，0.1mT的磁場對間充質干細胞無明顯影響，0.5mT和1.0mT的磁場抑制間充質干細胞的增殖,但促進增殖的內在機制并未深入研究。

綜上所述，目前國內外大量對于促進間充質干細胞體外大量增殖的研究，但對于采用何種方法存在不小的爭議，大量的研究結果也沒有系統的闡述促進間充質干細胞增殖的內在機制。因此，明確間充質干細胞增殖的內在機制并建立一套標準化的培養體系來實現間充質干細胞的大量增殖顯得十分必要。

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