小薊中綠原酸的UPLC分析

段紅波等

摘要：采用超高效液相色譜法（UPLC）測定小薊（Cephalanoplos segetum）中綠原酸含量。其中色譜柱為Acquity-BEH C18 （50×2.5 mm，1.7 μm）；流動相A和B分別為甲醇和0.1%（V/V）磷酸-水溶液，梯度洗脫，流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5.0 μL；檢測5.0 min；檢測波長327 nm。在該色譜條件下，小薊中的綠原酸無干擾峰，含量在5.0～60.0 μg/mL范圍內具有良好的線性關系，精密度、重復性和穩定性試驗結果的RSD分別為0.79%、2.70%和2.52%，平均回收率達101.0%。漢中小薊中的綠原酸含量為2.15±0.06 mg/g。色譜方法快速、簡便、穩定、可靠，為小薊及其他植物材料中綠原酸的含量分析提供了參考。

關鍵詞：超高效液相色譜法（UPLC）；小薊（Cephalanoplos segetum）；綠原酸；含量測定

中圖分類號：Q599 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3901-03

Abstract： The content of chlorogenic acid in Cephalanoplos segetum was analyzed with UPLC. The 5.0 μL sample was separated by Acquity BEH C18（50×2.5 mm，1.9 μm） with the gradient elution of methanol （A） and 0.1% H3PO4 solution （B） at the flow rate of 0.3 mL/min in 30 ℃ and detected at 327 nm for 5 min. The results showed that the linear detection range was 5.0～60.0 g/mL. RSD of precision， repeatability and stability was 0.79%， 2.70% and 2.52%， respectively. The recovery was 101.0%. The content of chlorogenic acid in Cephalanoplos segetum from Hanzhong was 2.15±0.06 mg/g. The chromatographic method was rapid， simple， stable and reliable. It will provide a reference for detecting chlorogenic acid in Cephalanoplos segetum and other plant.

Key words： UPLC； Cephalanoplos segetum； chlorogenic acid； determination

小薊（Cephalanoplos segetum）別名野紅花、小刺蓋、刺兒菜等，為菊科薊屬植物，藥用部分為干燥的地上部分。小薊莖呈圓柱形，上部有分枝，長5～30 cm， 直徑0.2～0.5 cm；表面為灰綠色或紫色，具縱棱及白色柔毛；質脆，易折斷，斷面中空。葉互生，無柄或有短柄；葉片上表面為綠褐色，下表面為灰綠色，表面均具白色柔毛。頭狀花序單個或數個頂生；總苞鐘狀，苞片5～8層，黃綠色，花紫紅色；氣微，味微苦[1]。小薊具有涼血止血，祛淤消腫的功效，可用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏下血，外傷出血，癰腫瘡毒等，為中醫臨床常用藥。分布于中國大部分地區，中歐、東歐、俄羅斯東部、日本、朝鮮亦有分布。一般生于荒地、草地、山坡林、路旁、灌叢、田間、林緣及溪旁，也有人工栽培作藥用[2]。

小薊中的有效成分比較復雜，含有機酸類、黃酮類、三萜類等化合物，其中綠原酸是小薊促進血液凝固，止血的主要功效成分[3-6]。綠原酸是一種重要的生物活性物質，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經等作用[7]。檢測小薊中綠原酸含量對小薊的品質評價以及綜合開發具有重要意義。

目前，檢測綠原酸的主要方法包括：分光光度法[8]、高效液相色譜法（HPLC）[9， 10]等。其中，基于HPLC建立的超高效液相色譜（Ultra PerformanceLiquid Chromatography，UPLC）技術，不僅可提高分析通量、靈敏度及色譜峰容量，更可極大提高檢測效率。本試驗通過優化條件，建立了一種適用于綠原酸的UPLC分析方法，以期為小薊的功能評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小薊采自于陜西省漢中市，經植物分類學副教授李會寧老師鑒定為小薊。將小薊洗干凈，40 ℃烘箱烘干，粉碎機粉碎過60目篩，密封，冷藏備用；綠原酸（98%，上海同田生物科技有限公司）。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY-UPLC帶PDA檢測器（美國Waters公司）；AUY220萬分之一電子天平，AUW220D 1/100 000電子天平（日本島津公司）；KQ100-DA超聲波儀（江蘇省昆山市淀山湖超聲儀器有限公司）；101-3A型電熱恒溫鼓風干燥箱（滬南電爐烘箱廠）；FZ102微型植物試樣粉碎機（北京市永光明醫療儀器廠）。

甲醇（色譜純，Burdick and Jackson 公司）；甲醇（分析純，天津市登峰化學試劑廠）；去離子水（娃哈哈食品有限公司）；磷酸（分析純，西安化學試劑二廠）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備 準確稱取2.50 mg 綠原酸， 用50%（V/V，下同）甲醇-水溶液溶解并定容至25.0 mL棕色容量瓶中，得100.0 μg/mL的綠原酸標準對照品母液。endprint

1.3.2 色譜條件 色譜柱為Acquity-BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）；流動相：A為甲醇，B為0.1%（V/V）磷酸水溶液，采用梯度洗脫，梯度為10%A（0 min）-50%A（4.0 min）-10%A（4.5 min）-10%A（5.0 min）；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5.0 μL，檢測時間5.0 min；檢測波長326 nm。

1.3.3 標準工作曲線的制備 吸取不同綠原酸標準母液0.5～6.0 mL用50%（體積比）甲醇-水溶液定容至10.0 mL棕色容量瓶中，配制不同濃度的綠原酸標準工作溶液。經0.25 μm 微孔濾膜過濾后，按照設定條件進樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制備標準工作曲線。

1.3.4 樣品溶液的制備 稱取0.2 g樣品，加40%甲醇-水溶液25.0 mL，稱定質量，超聲提取20 min，再次稱定質量，不足部分用40%甲醇補足。取小薊的甲醇提取液3.0 mL，過0.25 μm微孔濾膜，按照設定色譜條件進樣5.0 μL，根據標準工作曲線計算小薊中綠原酸的含量。設3組平行。

1.3.5 方法評價 按“1.3.4”制備樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下連續進樣5次，每次進樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積和RSD，考察方法精密度；按“1.3.4”制備5份樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下，進樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法重復性；按“1.3.4”制備樣品溶液，按“1.3.2”色譜條件下，分別于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h進樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法穩定性；稱取已測定綠原酸為2.15 mg/g的小薊樣品0.20 g，加入100.0 μg/mL標準品母液1 mL，同上法提取和分析，測定含量，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 波長確定

綠原酸標準品的200～400 nm紫外吸收光譜圖見圖1。由圖1可知，綠原酸最大紫外吸收波長為327 nm，參考文獻[11，12]，本試驗采用327 nm作為檢測波長。

2.2 標準工作曲線的建立

綠原酸標準品色譜圖見圖2。以綠原酸的色譜峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=316.20x-21.25，r=0.999 3，結果表明綠原酸在5.0～60.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3 方法學評價

2.3.1 精密度 按上述方法分析計算峰面積的RSD為0.79%（n=5），表明在該條件下方法精密度良好（RSD<3%）。

2.3.2 重復性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.70%（n=5），表明在該條件下方法重復性良好（RSD<3%）。

2.3.3 穩定性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.52%（n=5），表明在該條件下，綠原酸穩定性較好（RSD<3%），從峰面積上看，綠原酸隨著時間延長，其含量會降低。

2.3.4 回收率 按上述方法測定綠原酸的加樣回收率，回收率結果見表1。

綠原酸回收率結果表明，平均回收率為101.0%，RSD為2.19%，滿足分析要求（RSD<3%）。

2.4 樣品測定結果

按照測定樣品溶液制備方法，平行制備樣品溶液3份，在上述條件下分析檢測，小薊中的綠原酸含量結果見表2。

結果表明，樣品中的綠原酸含量為2.15 mg/g，平行測定的5組小薊中綠原酸含量差異不顯著。

3 討論

預試驗曾比較了體積比為10%～100%甲醇-水溶液提取效果，結果表明采用40%甲醇-水溶液提取樣品中的綠原酸峰面積最大，因此，選擇40%甲醇-水溶液為提取劑，后續試驗將重點圍繞提取劑條件中的超聲波功率、料液比、提取時間等因素展開。本試驗測定小薊中的綠原酸含量為2.15 mg/g，該結果與周建青等[8]，陳毓[9]，侯坤等[10]報道結果一致，但小于已報道的金銀花[11]和杜仲[13]中綠原酸含量。因此，綠原酸含量可能不能真實反映小薊品質特征，后續研究可圍繞其他活性物質開展分析[14， 15]。

另外，小薊在《中國藥典（2000版）》僅作了性狀和顯微描述，缺乏品質控制標準和分析方法，而在藥典（2005版）中小薊品質方面規定雖然有所增加，但相關檢測方法仍有不足，《藥典（2010版）》建立了小薊中有效成分含量檢測的通用方法。本試驗采用的UPLC法作為一種新型高效液相分析方法，具有精密度高，重復性好，準確可靠，簡便快速等特點，可為小薊中其他組分分析提供技術參考。

參考文獻：

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[9] 陳 毓. RP-HPLC測定小薊中綠原酸的含量[J]. 中國現代中藥， 2007，9（9）：12-14.

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[11] 江 海，魏 巍，丁 銳.HPLC測定漢中地區金銀花中綠原酸含量[J]. 陜西理工學院學報（自然科學版），2006，22（1）：87-90.

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[15] 葸玉琴，梁孔賢，常河林，等.響應曲面法優化微波輔助提取小薊中黃酮類化合物[J].西北師范大學學報（自然科學版）， 2011，47（6）：63-70.endprint

1.3.2 色譜條件 色譜柱為Acquity-BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）；流動相：A為甲醇，B為0.1%（V/V）磷酸水溶液，采用梯度洗脫，梯度為10%A（0 min）-50%A（4.0 min）-10%A（4.5 min）-10%A（5.0 min）；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5.0 μL，檢測時間5.0 min；檢測波長326 nm。

1.3.3 標準工作曲線的制備 吸取不同綠原酸標準母液0.5～6.0 mL用50%（體積比）甲醇-水溶液定容至10.0 mL棕色容量瓶中，配制不同濃度的綠原酸標準工作溶液。經0.25 μm 微孔濾膜過濾后，按照設定條件進樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制備標準工作曲線。

1.3.4 樣品溶液的制備 稱取0.2 g樣品，加40%甲醇-水溶液25.0 mL，稱定質量，超聲提取20 min，再次稱定質量，不足部分用40%甲醇補足。取小薊的甲醇提取液3.0 mL，過0.25 μm微孔濾膜，按照設定色譜條件進樣5.0 μL，根據標準工作曲線計算小薊中綠原酸的含量。設3組平行。

1.3.5 方法評價 按“1.3.4”制備樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下連續進樣5次，每次進樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積和RSD，考察方法精密度；按“1.3.4”制備5份樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下，進樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法重復性；按“1.3.4”制備樣品溶液，按“1.3.2”色譜條件下，分別于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h進樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法穩定性；稱取已測定綠原酸為2.15 mg/g的小薊樣品0.20 g，加入100.0 μg/mL標準品母液1 mL，同上法提取和分析，測定含量，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 波長確定

綠原酸標準品的200～400 nm紫外吸收光譜圖見圖1。由圖1可知，綠原酸最大紫外吸收波長為327 nm，參考文獻[11，12]，本試驗采用327 nm作為檢測波長。

2.2 標準工作曲線的建立

綠原酸標準品色譜圖見圖2。以綠原酸的色譜峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=316.20x-21.25，r=0.999 3，結果表明綠原酸在5.0～60.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3 方法學評價

2.3.1 精密度 按上述方法分析計算峰面積的RSD為0.79%（n=5），表明在該條件下方法精密度良好（RSD<3%）。

2.3.2 重復性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.70%（n=5），表明在該條件下方法重復性良好（RSD<3%）。

2.3.3 穩定性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.52%（n=5），表明在該條件下，綠原酸穩定性較好（RSD<3%），從峰面積上看，綠原酸隨著時間延長，其含量會降低。

2.3.4 回收率 按上述方法測定綠原酸的加樣回收率，回收率結果見表1。

綠原酸回收率結果表明，平均回收率為101.0%，RSD為2.19%，滿足分析要求（RSD<3%）。

2.4 樣品測定結果

按照測定樣品溶液制備方法，平行制備樣品溶液3份，在上述條件下分析檢測，小薊中的綠原酸含量結果見表2。

結果表明，樣品中的綠原酸含量為2.15 mg/g，平行測定的5組小薊中綠原酸含量差異不顯著。

3 討論

預試驗曾比較了體積比為10%～100%甲醇-水溶液提取效果，結果表明采用40%甲醇-水溶液提取樣品中的綠原酸峰面積最大，因此，選擇40%甲醇-水溶液為提取劑，后續試驗將重點圍繞提取劑條件中的超聲波功率、料液比、提取時間等因素展開。本試驗測定小薊中的綠原酸含量為2.15 mg/g，該結果與周建青等[8]，陳毓[9]，侯坤等[10]報道結果一致，但小于已報道的金銀花[11]和杜仲[13]中綠原酸含量。因此，綠原酸含量可能不能真實反映小薊品質特征，后續研究可圍繞其他活性物質開展分析[14， 15]。

另外，小薊在《中國藥典（2000版）》僅作了性狀和顯微描述，缺乏品質控制標準和分析方法，而在藥典（2005版）中小薊品質方面規定雖然有所增加，但相關檢測方法仍有不足，《藥典（2010版）》建立了小薊中有效成分含量檢測的通用方法。本試驗采用的UPLC法作為一種新型高效液相分析方法，具有精密度高，重復性好，準確可靠，簡便快速等特點，可為小薊中其他組分分析提供技術參考。

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[14] 曹 琴，陳建濤.小薊的化學成分研究[J].藥學實踐雜志， 2010，28（4）：271-274.

[15] 葸玉琴，梁孔賢，常河林，等.響應曲面法優化微波輔助提取小薊中黃酮類化合物[J].西北師范大學學報（自然科學版）， 2011，47（6）：63-70.endprint

1.3.2 色譜條件 色譜柱為Acquity-BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）；流動相：A為甲醇，B為0.1%（V/V）磷酸水溶液，采用梯度洗脫，梯度為10%A（0 min）-50%A（4.0 min）-10%A（4.5 min）-10%A（5.0 min）；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5.0 μL，檢測時間5.0 min；檢測波長326 nm。

1.3.3 標準工作曲線的制備 吸取不同綠原酸標準母液0.5～6.0 mL用50%（體積比）甲醇-水溶液定容至10.0 mL棕色容量瓶中，配制不同濃度的綠原酸標準工作溶液。經0.25 μm 微孔濾膜過濾后，按照設定條件進樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制備標準工作曲線。

1.3.4 樣品溶液的制備 稱取0.2 g樣品，加40%甲醇-水溶液25.0 mL，稱定質量，超聲提取20 min，再次稱定質量，不足部分用40%甲醇補足。取小薊的甲醇提取液3.0 mL，過0.25 μm微孔濾膜，按照設定色譜條件進樣5.0 μL，根據標準工作曲線計算小薊中綠原酸的含量。設3組平行。

1.3.5 方法評價 按“1.3.4”制備樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下連續進樣5次，每次進樣5.0 μL，測定綠原酸峰面積和RSD，考察方法精密度；按“1.3.4”制備5份樣品溶液，在“1.3.2”色譜條件下，進樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法重復性；按“1.3.4”制備樣品溶液，按“1.3.2”色譜條件下，分別于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h進樣5.0 μL，測定綠原酸的峰面積和RSD，考察方法穩定性；稱取已測定綠原酸為2.15 mg/g的小薊樣品0.20 g，加入100.0 μg/mL標準品母液1 mL，同上法提取和分析，測定含量，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 波長確定

綠原酸標準品的200～400 nm紫外吸收光譜圖見圖1。由圖1可知，綠原酸最大紫外吸收波長為327 nm，參考文獻[11，12]，本試驗采用327 nm作為檢測波長。

2.2 標準工作曲線的建立

綠原酸標準品色譜圖見圖2。以綠原酸的色譜峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=316.20x-21.25，r=0.999 3，結果表明綠原酸在5.0～60.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3 方法學評價

2.3.1 精密度 按上述方法分析計算峰面積的RSD為0.79%（n=5），表明在該條件下方法精密度良好（RSD<3%）。

2.3.2 重復性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.70%（n=5），表明在該條件下方法重復性良好（RSD<3%）。

2.3.3 穩定性 按上述方法分析計算峰面積的RSD為2.52%（n=5），表明在該條件下，綠原酸穩定性較好（RSD<3%），從峰面積上看，綠原酸隨著時間延長，其含量會降低。

2.3.4 回收率 按上述方法測定綠原酸的加樣回收率，回收率結果見表1。

綠原酸回收率結果表明，平均回收率為101.0%，RSD為2.19%，滿足分析要求（RSD<3%）。

2.4 樣品測定結果

按照測定樣品溶液制備方法，平行制備樣品溶液3份，在上述條件下分析檢測，小薊中的綠原酸含量結果見表2。

結果表明，樣品中的綠原酸含量為2.15 mg/g，平行測定的5組小薊中綠原酸含量差異不顯著。

3 討論

預試驗曾比較了體積比為10%～100%甲醇-水溶液提取效果，結果表明采用40%甲醇-水溶液提取樣品中的綠原酸峰面積最大，因此，選擇40%甲醇-水溶液為提取劑，后續試驗將重點圍繞提取劑條件中的超聲波功率、料液比、提取時間等因素展開。本試驗測定小薊中的綠原酸含量為2.15 mg/g，該結果與周建青等[8]，陳毓[9]，侯坤等[10]報道結果一致，但小于已報道的金銀花[11]和杜仲[13]中綠原酸含量。因此，綠原酸含量可能不能真實反映小薊品質特征，后續研究可圍繞其他活性物質開展分析[14， 15]。

另外，小薊在《中國藥典（2000版）》僅作了性狀和顯微描述，缺乏品質控制標準和分析方法，而在藥典（2005版）中小薊品質方面規定雖然有所增加，但相關檢測方法仍有不足，《藥典（2010版）》建立了小薊中有效成分含量檢測的通用方法。本試驗采用的UPLC法作為一種新型高效液相分析方法，具有精密度高，重復性好，準確可靠，簡便快速等特點，可為小薊中其他組分分析提供技術參考。

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