雙酶分步水解低值魚蛋白的研究

摘要：選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶兩種酶對低值魚蛋白進行分步水解，分析各因素對魚蛋白水解的影響，以水解度為特征性指標。單因素試驗結果表明，先添加中性蛋白酶的水解效果優于先添加木瓜蛋白酶。通過 L9（34）正交試驗確定水解的最佳條件為水解時間為6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶量比（g∶g）為3∶1，水解溫度為55 ℃，料液比（m/V，g∶mL）為1∶10，水解效果是最好的，在此條件下水解度為35.85%。

關鍵詞：低值魚蛋白；分步水解；中性蛋白酶；木瓜蛋白酶；水解度

中圖分類號：S661.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3890-03

Abstract： The neutral protease and the papain were used to hydrolyze the low-price fish protein and study the process condition of enzymatic hydrolysis. The effects of dosage of enzyme， concentration of substrate， temperature of enzymatic hydrolysis， pH value etc were analyzed. The results showed that it was better to add neutral protease at first than to add the papain at first. The optimal conditions were the ratio of the neutral protease and the papain of 5∶1， the time of hydrolysis of 6 h， the concentration of substrate（m/V） of 1∶10， the temperature of enzymolysis of 55 ℃， pH 7.0. Under which， the hydrolysis could be 35.85%.

Key words： the low-price fish protein； step by step hydrolysis； neutral protease； papain； degree of hydrolysis

中國海域遼闊，其面積為陸地面積的1/3，是一個海洋大國。海洋魚類是一項可持續發展的資源，它是人類生存所需動物蛋白的主要來源[1]。然而隨著捕撈強度的增大，海洋漁業資源逐年衰減，海洋捕撈的中低值魚產量呈上升趨勢，占海洋捕撈產量的57%～59%，而這些中低值魚用于食品加工的僅占30%[2]，表明資源未得到充分利用。因此，研究如何利用低值小雜魚顯得十分必要。目前，世界各國均在研究開發新產品，中國也在積極跟進，研究低值小海魚用于調味品的生產、生產魚體分解蛋白以及其他的一些產品，但都未形成規模生產，產量也不大。因此，在低值海洋小雜魚的綜合利用方面，有待進一步研究和開發。本試驗利用資源豐富的低值海魚蛋白，采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行酶解，目的是找出最佳的水解途徑，豐富低值海魚功能食品開發和利用。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮低值海魚：購于潮州市橋東市場；中性蛋白酶（BR，江西銳陽生物科技有限公司，酶活力5萬U/mg）；木瓜蛋白酶（BR，江西銳陽生物科技有限公司，酶活力80萬U/mg）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SHP501型超級恒溫槽（上海恒平科學儀器有限公司）；KDN型調溫電熱套（常州國華儀器有限公司）；電子天平、半微量凱氏定氮儀（上海精密科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程 低值海魚→蒸熟→研細→魚泥→稱量→加酶水解→滅酶（沸水浴10 min）→冷卻→離心10 min收集所有上清液定容測定游離氨態氮。

1.3.2 測定方法 總氮采用凱氏定氮法[3]；氨態氮采用雙指示劑甲醛滴定法[4，5]；蛋白質水解度（DH）=

氨態氨/總氮×100%

1.3.3 試驗設計[6-10] 以酶添加順序、兩種酶的用量比例、水解溫度、料液比和水解時間為影響蛋白質水解的因素，先通過試驗考察各單因素對水解度的影響，再設計正交試驗L9（34）來確定木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解低值海魚的最佳條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶添加順序和溫度對水解效果的影響 為確定兩種酶的添加順序，分別采用水解溫度45、50、55、60、65 ℃，在兩種酶的總濃度為0.3%、兩種酶用量比例（m∶m）為1∶1，料液比（m/V，g∶mL，下同）為1∶10，水解時間為4 h。選取2種酶添加順序：①中性蛋白酶先水解2 h后，滅酶后加入木瓜蛋白酶；②木瓜蛋白酶先水解2 h，中性蛋白酶后水解。研究酶添加順序和溫度對水解度的影響，結果見圖1。由圖1 可知，按照①的添加順序進行的魚蛋白的水解效果更好，即水解度更高。在50～60 ℃范圍內，水解效果較好，當為55 ℃時，兩種水解方式的水解度均為最高，這主要是因為在這個溫度下酶的活力是最大的，較低溫度時酶的活力比較小，而溫度太高時由于蛋白質變性使得活性降低。因此，綜合考慮選定酶的添加順序按照①的方法進行，即添加中性蛋白酶先水解2 h，滅酶后再加入木瓜蛋白酶進行水解。

2.1.2 兩種酶的用量比對水解效果的影響 按照試驗“2.1.1”將兩種酶的總濃度定為0.3%，在溫度為55 ℃，低值海魚料液比1∶10，水解時間為4 h，分別在中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的用量比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1條件下進行水解反應，通過水解度的具體數值確定兩種酶的最佳用量比。結果見圖2。由圖2可知，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的比例對魚蛋白的水解度影響很大，水解效果較好時兩種酶的比例為5∶1～3∶1，并且當中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例為5∶1時，水解效果是最好的，之后隨著木瓜蛋白酶比例的增加，水解度反而有所下降，故在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的分步水解過程中采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例為5∶1比較合適。endprint

2.1.3 料液比對水解效果的影響 采用兩種酶的總濃度為0.3%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比例為5∶1，水解溫度為55 ℃，分別以低值海魚料液比為1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5進行水解4 h，探究不同料液比對水解效果的影響。結果見圖3。由圖3可知，料液比對木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解效果存在一定的影響，在料液比為1∶25到1∶5的過程中，隨著低值海魚量的增加，水解度呈先增大后減少的趨勢。當料液比為1∶20時，水解度達到最大，之后隨著低值海魚量的增加，水解度反而有所降低。這可能是由于低值海魚濃度過高時，水解度受酶的用量的制約，所以低值海魚料液比為1∶20比較合適。

2.1.4 水解時間對水解效果的影響 在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的總酶濃度為0.3%，其比例為5∶1，在料液比為1∶20，反應溫度55 ℃，水解時間分別為 3、4、5、6、7 h條件下進行水解反應，研究水解時間對水解度的影響，其結果見圖4。從圖4可以看出，隨著水解時間的增加，魚蛋白的水解度也隨著增大，在5～7 h范圍內效果較好，在5 h時達到最大值，當水解時間繼續增加時，水解度反而略微下降。因此，從經濟的角度考慮，水解的最佳作用時間不宜過長，以5 h左右比較合適。

2.2 魚蛋白雙酶分步水解最佳條件的確定

根據單因素試驗結果可知，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的用量比例、水解時間、水解溫度、料液比均對水解效果有一定的影響。考慮到水解過程是受以上各因素的綜合影響，設計L9（34）正交試驗以確定其最佳水解條件。試驗結果見表1。采用直觀分析法對各因素極差R值大小比較可知，各因素對中性蛋白酶與木瓜蛋白酶分步水解效果影響的大小順序是水解溫度、水解時間、料液比、雙酶用量比例。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解魚蛋白的最佳水解條件是水解時間6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比為3∶1，水解溫度55 ℃，料液比1∶10，該組合沒有出現在正交表里，進行驗證性試驗結果表明，在該條件下測得水解度為35.85%，大于正交表里的最大值35.14%，說明此正交試驗是成功的，結果可靠。

3 結論

中性蛋白酶和木瓜蛋白酶是高效蛋白水解酶， 用于水解魚肉蛋白可以獲得水解度較高的水解液。試驗結果表明，在采用兩種酶進行分步水解時，按照先添加中性蛋白酶進行水解，后添加木瓜蛋白酶的酶添加順序進行水解，水解效果優于先添加木瓜蛋白酶后添加中性蛋白酶的順序。在研究蛋白酶水解魚蛋白的影響因素中，水解溫度是影響雙酶分步水解魚蛋白的主要因素，其次是水解時間、料液比，雙酶用量比例對水解度的影響最小。對魚蛋白的水解進行正交試驗，獲得中性蛋白酶與木瓜蛋白酶分步水解魚蛋白的最佳工藝條件為水解時間為6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶用量比例為3∶1，水解溫度為55 ℃，料液比為1∶10，水解效果較好，此時水解度為35.85%。

參考文獻：

[1]陳清潮.我國海洋魚類資源面臨的問題和出路[J].南海研究與開發，2001，13（1）：45-47.

[2]吳 敏，尹彥洋，羅愛平，等.雙酶分步水解牛骨蛋白工藝的優化[J].食品科學，2009，30（20）：233-226.

[3] 涂宗財，陳劍兵，劉 偉，等.水解魚鱗膠制備小分子多肽的研究[J].食品科學，2005，26（8）：210-212.

[4] GB 5009.6-1985.食品衛生理化檢驗手冊[S].

[5] 陳 晶，熊善柏，李 潔，等.白鱗魚骨蛋白酶水解工藝研究[J].食品科學，2006，27（11）：326-330.

[6]周燕芳.鯽魚水解條件的研究[J].食品研究與開發，2008，29（8）：77-79.

[7]顧 林，孫 婧.鯽魚蛋白水解及其中性蛋白酶水解液抗氧化活性研究[J].食品科學，2008，29（8）：177-180.

[8]陳 晶，劉友明，熊善柏，等.復合蛋白酶與風味蛋白酶分步水解魚骨蛋白工藝的優化[J].華中農業大學學報，2007，26（5）：704-708.

[9]金 晶，徐志宏，魏振承，等.雙酶分步水解制備菜籽蛋白肽[J].食品與生物技術學報，2010，29（1）：50-55.

[10]張根生，何麗瑩，岳曉霞，等.風味蛋白酶與復合蛋白酶分步水解脫脂碎肉粉工藝的優化[J].中國調味品，2011，36（1）：17-21.

（責任編輯 龍小玲）endprint

2.1.3 料液比對水解效果的影響 采用兩種酶的總濃度為0.3%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比例為5∶1，水解溫度為55 ℃，分別以低值海魚料液比為1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5進行水解4 h，探究不同料液比對水解效果的影響。結果見圖3。由圖3可知，料液比對木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解效果存在一定的影響，在料液比為1∶25到1∶5的過程中，隨著低值海魚量的增加，水解度呈先增大后減少的趨勢。當料液比為1∶20時，水解度達到最大，之后隨著低值海魚量的增加，水解度反而有所降低。這可能是由于低值海魚濃度過高時，水解度受酶的用量的制約，所以低值海魚料液比為1∶20比較合適。

2.1.4 水解時間對水解效果的影響 在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的總酶濃度為0.3%，其比例為5∶1，在料液比為1∶20，反應溫度55 ℃，水解時間分別為 3、4、5、6、7 h條件下進行水解反應，研究水解時間對水解度的影響，其結果見圖4。從圖4可以看出，隨著水解時間的增加，魚蛋白的水解度也隨著增大，在5～7 h范圍內效果較好，在5 h時達到最大值，當水解時間繼續增加時，水解度反而略微下降。因此，從經濟的角度考慮，水解的最佳作用時間不宜過長，以5 h左右比較合適。

2.2 魚蛋白雙酶分步水解最佳條件的確定

根據單因素試驗結果可知，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的用量比例、水解時間、水解溫度、料液比均對水解效果有一定的影響。考慮到水解過程是受以上各因素的綜合影響，設計L9（34）正交試驗以確定其最佳水解條件。試驗結果見表1。采用直觀分析法對各因素極差R值大小比較可知，各因素對中性蛋白酶與木瓜蛋白酶分步水解效果影響的大小順序是水解溫度、水解時間、料液比、雙酶用量比例。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解魚蛋白的最佳水解條件是水解時間6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比為3∶1，水解溫度55 ℃，料液比1∶10，該組合沒有出現在正交表里，進行驗證性試驗結果表明，在該條件下測得水解度為35.85%，大于正交表里的最大值35.14%，說明此正交試驗是成功的，結果可靠。

3 結論

中性蛋白酶和木瓜蛋白酶是高效蛋白水解酶， 用于水解魚肉蛋白可以獲得水解度較高的水解液。試驗結果表明，在采用兩種酶進行分步水解時，按照先添加中性蛋白酶進行水解，后添加木瓜蛋白酶的酶添加順序進行水解，水解效果優于先添加木瓜蛋白酶后添加中性蛋白酶的順序。在研究蛋白酶水解魚蛋白的影響因素中，水解溫度是影響雙酶分步水解魚蛋白的主要因素，其次是水解時間、料液比，雙酶用量比例對水解度的影響最小。對魚蛋白的水解進行正交試驗，獲得中性蛋白酶與木瓜蛋白酶分步水解魚蛋白的最佳工藝條件為水解時間為6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶用量比例為3∶1，水解溫度為55 ℃，料液比為1∶10，水解效果較好，此時水解度為35.85%。

參考文獻：

[1]陳清潮.我國海洋魚類資源面臨的問題和出路[J].南海研究與開發，2001，13（1）：45-47.

[2]吳 敏，尹彥洋，羅愛平，等.雙酶分步水解牛骨蛋白工藝的優化[J].食品科學，2009，30（20）：233-226.

[3] 涂宗財，陳劍兵，劉 偉，等.水解魚鱗膠制備小分子多肽的研究[J].食品科學，2005，26（8）：210-212.

[4] GB 5009.6-1985.食品衛生理化檢驗手冊[S].

[5] 陳 晶，熊善柏，李 潔，等.白鱗魚骨蛋白酶水解工藝研究[J].食品科學，2006，27（11）：326-330.

[6]周燕芳.鯽魚水解條件的研究[J].食品研究與開發，2008，29（8）：77-79.

[7]顧 林，孫 婧.鯽魚蛋白水解及其中性蛋白酶水解液抗氧化活性研究[J].食品科學，2008，29（8）：177-180.

[8]陳 晶，劉友明，熊善柏，等.復合蛋白酶與風味蛋白酶分步水解魚骨蛋白工藝的優化[J].華中農業大學學報，2007，26（5）：704-708.

[9]金 晶，徐志宏，魏振承，等.雙酶分步水解制備菜籽蛋白肽[J].食品與生物技術學報，2010，29（1）：50-55.

[10]張根生，何麗瑩，岳曉霞，等.風味蛋白酶與復合蛋白酶分步水解脫脂碎肉粉工藝的優化[J].中國調味品，2011，36（1）：17-21.

（責任編輯 龍小玲）endprint

2.1.3 料液比對水解效果的影響 采用兩種酶的總濃度為0.3%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比例為5∶1，水解溫度為55 ℃，分別以低值海魚料液比為1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5進行水解4 h，探究不同料液比對水解效果的影響。結果見圖3。由圖3可知，料液比對木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解效果存在一定的影響，在料液比為1∶25到1∶5的過程中，隨著低值海魚量的增加，水解度呈先增大后減少的趨勢。當料液比為1∶20時，水解度達到最大，之后隨著低值海魚量的增加，水解度反而有所降低。這可能是由于低值海魚濃度過高時，水解度受酶的用量的制約，所以低值海魚料液比為1∶20比較合適。

2.1.4 水解時間對水解效果的影響 在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的總酶濃度為0.3%，其比例為5∶1，在料液比為1∶20，反應溫度55 ℃，水解時間分別為 3、4、5、6、7 h條件下進行水解反應，研究水解時間對水解度的影響，其結果見圖4。從圖4可以看出，隨著水解時間的增加，魚蛋白的水解度也隨著增大，在5～7 h范圍內效果較好，在5 h時達到最大值，當水解時間繼續增加時，水解度反而略微下降。因此，從經濟的角度考慮，水解的最佳作用時間不宜過長，以5 h左右比較合適。

2.2 魚蛋白雙酶分步水解最佳條件的確定

根據單因素試驗結果可知，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的用量比例、水解時間、水解溫度、料液比均對水解效果有一定的影響?？紤]到水解過程是受以上各因素的綜合影響，設計L9（34）正交試驗以確定其最佳水解條件。試驗結果見表1。采用直觀分析法對各因素極差R值大小比較可知，各因素對中性蛋白酶與木瓜蛋白酶分步水解效果影響的大小順序是水解溫度、水解時間、料液比、雙酶用量比例。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解魚蛋白的最佳水解條件是水解時間6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比為3∶1，水解溫度55 ℃，料液比1∶10，該組合沒有出現在正交表里，進行驗證性試驗結果表明，在該條件下測得水解度為35.85%，大于正交表里的最大值35.14%，說明此正交試驗是成功的，結果可靠。

3 結論

中性蛋白酶和木瓜蛋白酶是高效蛋白水解酶， 用于水解魚肉蛋白可以獲得水解度較高的水解液。試驗結果表明，在采用兩種酶進行分步水解時，按照先添加中性蛋白酶進行水解，后添加木瓜蛋白酶的酶添加順序進行水解，水解效果優于先添加木瓜蛋白酶后添加中性蛋白酶的順序。在研究蛋白酶水解魚蛋白的影響因素中，水解溫度是影響雙酶分步水解魚蛋白的主要因素，其次是水解時間、料液比，雙酶用量比例對水解度的影響最小。對魚蛋白的水解進行正交試驗，獲得中性蛋白酶與木瓜蛋白酶分步水解魚蛋白的最佳工藝條件為水解時間為6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶用量比例為3∶1，水解溫度為55 ℃，料液比為1∶10，水解效果較好，此時水解度為35.85%。

參考文獻：

[1]陳清潮.我國海洋魚類資源面臨的問題和出路[J].南海研究與開發，2001，13（1）：45-47.

[2]吳 敏，尹彥洋，羅愛平，等.雙酶分步水解牛骨蛋白工藝的優化[J].食品科學，2009，30（20）：233-226.

[3] 涂宗財，陳劍兵，劉 偉，等.水解魚鱗膠制備小分子多肽的研究[J].食品科學，2005，26（8）：210-212.

[4] GB 5009.6-1985.食品衛生理化檢驗手冊[S].

[5] 陳 晶，熊善柏，李 潔，等.白鱗魚骨蛋白酶水解工藝研究[J].食品科學，2006，27（11）：326-330.

[6]周燕芳.鯽魚水解條件的研究[J].食品研究與開發，2008，29（8）：77-79.

[7]顧 林，孫 婧.鯽魚蛋白水解及其中性蛋白酶水解液抗氧化活性研究[J].食品科學，2008，29（8）：177-180.

[8]陳 晶，劉友明，熊善柏，等.復合蛋白酶與風味蛋白酶分步水解魚骨蛋白工藝的優化[J].華中農業大學學報，2007，26（5）：704-708.

[9]金 晶，徐志宏，魏振承，等.雙酶分步水解制備菜籽蛋白肽[J].食品與生物技術學報，2010，29（1）：50-55.

[10]張根生，何麗瑩，岳曉霞，等.風味蛋白酶與復合蛋白酶分步水解脫脂碎肉粉工藝的優化[J].中國調味品，2011，36（1）：17-21.

（責任編輯 龍小玲）endprint