綠色木霉Fn10—1纖維素酶的分離純化及酶學特性測定

王剛等

摘要：試驗研究了綠色木霉Fn10-1纖維素酶的初步純化及酶學性質開展研究。結果表明，該纖維素酶的最適催化溫度為70 ℃，最適pH 7.6，在溫度為4～50 ℃下均能保持較穩(wěn)定的酶活，高于50 ℃以后，熱穩(wěn)定性變差，酶活力開始急劇下降。pH在5.6～7.6時該酶有較好的穩(wěn)定性。Na+、Mn2+、Fe2+、Mg2+、Co2+、Ca2+、Ba2+、Al3+對纖維素酶具有一定的激活作用，Ag+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、K+對該酶有一定的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用尤為明顯。

關鍵詞： 纖維素酶；綠色木霉；純化；酶學性質

中圖分類號：Q55；Q814 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3874-03

Abstract： Trichoderma viride Fn10-1 was purified with ammonium sulfate precipitation and analyzed its enzymatic characteristics. The results showed that the optimal catalysis temperature and pH of this cellulase were 70 ℃and 7.6， respectively. The enzymatic activity was stable under 4～50℃， but declined sharply above 50 ℃. It was stable when pH was 5.6～7.6. Na+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Mg2+，Co2+，Ca2+，Ba2+and Al3+ were its activator， Ag+ ，F(xiàn)e3+ ，Cu2+ ，Zn2+and K+ were its inhibitors， among then Cu2+ had obvious inhibition.

Key words： cellulase； Trichoderma viride； purification； enzyme characteristic

纖維素類物質是自然界中最廉價、含量最豐富的可再生資源。但人類或大部分動物都無法直接消化纖維素，以至于大部分植物纖維素只能被燒掉或自然腐爛，僅有一小部分被人類所利用[1]。既浪費了自然資源，又造成了嚴重的環(huán)境污染，已有報道燃燒秸稈導致交通事故的大量案例。目前降解纖維素的主要方法有酸法、堿法、酶法、機械法及離子輻射法[2]。纖維素酶主要去除植物細胞壁中的纖維素，將纖維素水解為葡萄糖等，實現(xiàn)在食品工業(yè)、飼料工業(yè)、輕工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、能源資源和鉆井等方面的應用[3]。

近年來，纖維素酶在飼料加工行業(yè)得到了廣泛的應用。和Walsh等[4]發(fā)現(xiàn)在單胃動物飼料中添加葡聚糖酶和木聚糖酶，能顯著提高飼料消化率和吸收率，增加動物體重。Kung等[5]也將含高活性纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的復合酶制劑用于提高飼料的營養(yǎng)價值，發(fā)現(xiàn)可有效提高飼料利用率，Burroughs等[6]報道酶制劑對增重和產奶沒有顯著影響。Beauehemin等[7]將草飼料經商品纖維素酶處理，奶牛產奶量可增加5%～25%。

纖維素酶已成為飼用酶家族的一個主要組成成員，如何從源頭提高纖維素酶酶活、改善酶解效率，了解掌握酶的特性，降低纖維素酶的成本是近年來研究的熱點問題[8]。雖然中國是農業(yè)大國，植物資源豐富，地大物博，但是飼料資源緊張，人畜爭糧的矛盾仍十分嚴峻。因此，本研究進行了纖維素酶酶學特性研究，為其更好地應用于飼料加工，提供一定的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠色木霉Fn10-1，由吉林農業(yè)大學生命科學學院提供。

1.2 培養(yǎng)基

PDA固體斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 1.4 g，KH2PO4 2.0 g，CaCl2 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g， CMC-Na 10 g，蛋白胨 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，吐溫-80 2 mL，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.3 方法

1.3.1 纖維素酶的粗分離

1）硫酸銨分級沉淀飽和度確定。發(fā)酵液10 000 r/min離心，取上清液調硫酸銨的飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，置4 ℃冰箱靜置過夜。10 000 r/min條件下離心15 min，測上清液和沉淀中的酶活。

2）分級沉淀。取100 mL粗酶液，按上述“1）”確定的最佳硫酸銨飽和度分級沉淀酶液， 4 ℃冰箱中靜止過夜，10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，透析，備用。

1.3.2 酶最適反應溫度 取酶液0.5 mL，1% CMC底物2 mL，分別于4、20、30、40、50、60、70、80 ℃進行酶催化反應，測CMC酶活。

1.3.3 熱穩(wěn)定性 取酶液分別置于4、20、30、40、50、60、70、80 ℃保溫，每隔1 h取0.5 mL粗酶液，測CMC酶活。

1.3.4 酶最適pH 配制pH范圍為3～9的磷酸鹽緩沖液，在最適的溫度下測酶活。

1.3.5 酶的pH穩(wěn)定性 取酶液置于不同pH緩沖液中，混勻后封口過夜，測CMC酶活，以酶活最高的pH條件下所得到的測定值為100%。

1.3.6 金屬離子影響 取酶液7 mL，分別加入1 mmol/L不同的金屬離子，包括Na+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Ag+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、K+、Co2+、Al3+，測CMC酶活。endprint