衍生化技術在色譜法檢測有機農藥殘留中的應用

熊琳等

摘要：近年來，農藥殘留檢測技術取得了較快的發展，其中色譜法由于具有高效、高靈敏度、便捷的優點，成為農藥殘留檢測最主要的手段。但由于受到檢測儀器的限制，常規的色譜法對一些農藥殘留無法測定，通過殘留物與衍生化試劑的化學反應，使這些殘留物能夠被檢測儀器檢測，這就顯著地擴大了色譜法的使用范圍。對衍生化技術在色譜法檢測有機農藥殘留中的應用作了較為全面的闡述，旨在為農產品風險評估提供更好地服務。

關鍵詞：農藥殘留；衍生化；色譜法

中圖分類號：O657.7；S481+.8 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3725-06

Abstract： In recent years， the technologies of detecting pesticide residues have been developed rapidly. The chromatography becomes the main method for detecting pesticide residual due to its high efficiency， sensitivity and convenience. Limited by the detector， the conventional chromatographic method can not detect all residues. Detecting the residues through the chemical reaction between the residues and the derivation reagents can it greatly expand the scope of application of chromatography. Derivatization in detecting organic pesticide residues with chromatography was reviewed in this paper.

Key words： pesticide residues； derivatization； chromatography

有機農藥可以分為有機氯、有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等四大類。隨著農藥的大量生產和廣泛使用，農藥殘留問題日益突出，造成了嚴重的農藥污染問題，對人體健康也構成了嚴重威脅[1，2]。目前測定農藥殘留的主要方法有色譜法、毛細管電泳法[3]、免疫分析法[4]、生物傳感器法等[5]。毛細管電泳法所采用的儀器為一些普及度較低的特殊儀器，所用試劑一般價格昂貴，還不能大規模地推廣使用；生物傳感器法是近年來才出現的新方法，應用范圍不廣，僅限于有機磷等少數農藥殘留檢測，并且該方法靈敏度和準確度都不太穩定；免疫分析法同樣僅限于少數農藥殘留檢測，一次只能檢測1種化合物，而且需要大量板管等器件，成本較高。而色譜法具有高選擇性、高分離效能、高靈敏度、快速等優點，因而是農藥殘留檢測最常用、最有效的方法。但色譜法也有自身的缺點，有些農藥殘留物對檢測儀器沒有響應或響應較弱，不能直接檢測，需要進行衍生化處理。衍生化技術可以擴大檢測物的范圍，提高樣品在檢測儀器上的靈敏度，改善樣品混合物在色譜柱上的分離效果[6]。衍生化技術對于增加農藥殘留檢測的種類、降低檢測成本和儀器采購投入、保障飲食安全、提升中國農產品國際競爭力具有重要意義。

1 有機農藥殘留檢測中衍生化技術簡介

有機農藥殘留檢測中的色譜法可以分為：薄層色譜法[7]、氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9，10]、超臨界流體色譜法、氣相色譜-質譜法[11]和液相色譜-質譜法[12]等。其中氣相色譜法、液相色譜法和色譜-質譜聯用法是監測檢驗部門分析農藥殘留的主要方法[13]。薄層色譜法常用于快速定性檢測，一般不涉及衍生化問題；超臨界流體色譜法在實際生產中應用較少。氣相色譜法適合分析有足夠揮發性的物質，對極性強、揮發性低、熱穩定性差的物質往往不能直接進樣分析，但如果進行適當的化學處理[14]，轉化成相應的揮發性衍生物就可以檢測，擴大了氣相色譜法的測定范圍[15]；液相色譜法在分析中一般要求被測樣品有紫外吸收[16]或能被激發產生熒光，對于無紫外吸收或紫外吸收較弱，不發熒光或熒光較弱的樣品靈敏度很低，甚至不能檢測，也需要進行衍生化處理。

1.1 農藥殘留檢測中衍生化機理

常用于農藥殘留檢測的衍生化試劑有：硅烷化試劑、烷基化試劑、酰基化試劑、紫外衍生試劑、熒光衍生試劑等。硅烷化試劑可以將硅烷基引入到分子中，一般是取代活性氫，降低化合物的極性，減少氫鍵束縛，所形成的硅烷化衍生物更容易揮發。同時由于含活性氫的反應位點數目減少，化合物的穩定性也得以加強，被檢測性能增強。適用于羥基化合物，也可用于含羧基、巰基、胺基等官能團的化合物；烷基化試劑與硅烷化試劑類似，是將烷基官能團（脂肪族或芳香族）添加到活性官能團（H）上，以烷基基團代替氫的重要性在于生成的衍生物與原來化合物相比極性大為下降。該類試劑常用于改良含有酸性氫的化合物，如羧酸類和苯酚類；酰基化試劑可通過羧酸或共衍生物的作用將含有活潑氫（例如-OH、-SH、-NH）的化合物轉化為酯、硫酯或酰胺，可以作為烷基化試劑的替代方法；紫外衍生試劑和熒光衍生試劑都屬于改善檢測性能的衍生化試劑。一般當物質在200～400 nm有紫外吸收時，考慮用紫外檢測儀器，紫外衍生化試劑可以改善物質的紫外吸收效應。熒光檢測儀器只對熒光物質有響應，靈敏度也高，適合于多環芳烴及各種熒光物質的痕量分析。不發熒光的物質，經熒光衍生試劑處理后可轉變為熒光物質，而后進行分析。

1.2 農藥殘留檢測中常見衍生化試劑

在農藥殘留檢測中，可根據待測農藥試樣所含官能團的種類選擇適宜的衍生試劑，各種常見衍生試劑的種類、代表物以及特點如表1所示。

2 衍生化技術在色譜法檢測有機氯農藥中的應用

有機氯農藥屬于神經毒物，在外界環境或有機體內均不易分解[17]，容易造成殘留，致人慢性中毒，損害中樞神經系統，嚴重危害人體健康。由于有機氯農藥的高殘留特點，在食品農藥殘留研究中最受重視[18]。鹵素具有較強的電負性，因此多數有機氯農藥使用帶有電子捕獲檢測儀器的氣相色譜儀可以直接測定，部分電負性較弱或揮發性不好的有機氯農藥需要進行衍生化處理，常見的是（硅）烷基化衍生試劑，例如三甲硅基重氮甲烷、五氟苯基重氮甲烷、五氟芐基溴等。有機氯農藥與這些試劑反應可以增加親電力，提高揮發性，使之適合于靈敏的電子捕獲檢測儀器。趙守成等[19]用氣相色譜-質譜法同時檢測大米中3，5-二氯苯甲酸、麥草畏、2，4-D丙酸、2，4-D、五氯苯酚等12種酸性除草劑，其中有8種是有機氯農藥，樣品用重氮甲烷乙醚溶液衍生化，該法回收率>80%，相對標準偏差<10%，最低檢測限為0.01～0.05 mg/kg，檢測限低、回收率比較理想，滿足殘留檢測的要求。Moy等[20]用高效液相色譜法測定水中百草敵、2，4-D等多種有機氯除草劑和其他幾種酸性除草劑，用三甲基硅烷化重氮甲烷作為衍生化試劑。黎源倩等[21]用帶有電子捕獲檢測儀器的氣相色譜儀分析糧食中綠麥隆殘留量，提純凈化后的洗脫液經濃縮后用七氟丁酸酯直接衍生。

3 衍生化技術在色譜法檢測有機磷農藥中的應用

有機磷農藥能夠抑制體內的膽堿酶，使其失去分解乙酰膽堿的能力，從而造成體內乙酰膽堿的積累，刺激中樞神經系統[22]，使各項功能失調，引起生理紊亂，因此對有機磷農藥殘留的檢測是十分必要的，而且有機磷農藥殘留是中國農藥殘留檢測的重點[23]，氣相色譜法被中國及世界上大多數國家作為有機磷農藥殘留檢測的標準方法或仲裁方法。用氣相或液相檢測都可能涉及到衍生化的問題，其中氣相衍生化試劑主要是利用烷基化試劑和酰基化試劑，將有機磷轉化為酯類或者醚類化合物，提高有機磷的揮發性。在液相色譜檢測中主要是用熒光衍生化試劑熒光胺、丹酰氯、芴代甲氧基酰氯等，在這些衍生化試劑中使用最多、衍生條件最成熟的是芴代甲氧基酰氯，衍生化反應方程式如圖1所示。劉錚錚等[24]先用芴代甲氧基酰氯衍生水中的草甘膦、草銨膦和氨甲基磷酸等，再用配有熒光檢測儀器的高效液相色譜儀進行檢測，建立一種快速、靈敏、準確地測定水中痕量新型有機磷除草劑的分析方法，平均加標回收率分別為94.2%、90.8%、98.6%，相對標準偏差分別為4.80%、0.68%、2.80%，定性下限和定量下限分別為0.050、0.040、0.009 μg/L和0.16、0.12、0.03 g/L。Freuze等[25]在研究水中草甘膦、氨甲基磷酸與多價陽離子絡合作用的影響時，也使用芴代甲氧基酰氯作為衍生化試劑，帶有熒光檢測儀器的高效液相色譜儀檢測。曹趙云等[26]采用液相色譜-質譜法建立稻米中草甘膦及氨甲基磷酸殘留量的測定方法，試樣經水提取和C18固相萃取柱凈化后，在硼酸緩沖液中與芴代甲氧基酰氯進行衍生反應。

另外，Zhou等[27]用帶有激光感應熒光檢測儀器的膠束電動色譜分析法（MEKC），全自動檢測河水中的有機磷農藥，試驗中采用毛細管柱衍生法對有機磷樣品進行在線衍生，首次采用4-氟-7-硝基苯并噁唑作為衍生化試劑，草銨膦和草甘膦的檢出限分別是2.8 ng/mL和32.2 ng/mL，比傳統的柱前衍生要好。鄔春華等[28]采用毛細管氣相色譜法，測定尿樣中二烷基磷酸酯類有機磷農藥代謝物的含量，樣品提取物與五氟溴芐苯（PFBBr）衍生化，衍生化反應主要分兩步進行，首先衍生試劑的溴原子脫離，形成帶正電荷的基團，再與離子化的二烷基（硫代）磷酸酯結合生成衍生物，反應方程式如圖2所示。樣品的加標回收率為70.2%～93.2%，相對標準偏差小于10.0%。該方法穩定性好、靈敏度高、重現性好。

4 衍生化技術在色譜法檢測擬除蟲菊酯類農藥中的應用

擬除蟲菊酯類農藥是一類廣譜性殺蟲劑，具有高效、低毒、生物降解性好等優點。它們是酯類化合物，具有較低的沸點，大多數是液體和低沸點固體，容易液化，因此大多數使用氣相色譜法[29，30]、氣相色譜-質譜法[31]等檢測，待測樣品一般沒有衍生化的要求。

5 衍生化技術在色譜法檢測氨基甲酸酯類農藥中的應用

氨基甲酸酯類農藥具有高效、低殘留、殺蟲譜廣、低毒、選擇性高等優點，已經替代高毒農藥得到廣泛應用[31]。但是這類農藥一旦進入人體內，可生成具有致癌作用的亞硝基化合物，因此氨基甲酸酯類農藥并不是絕對安全的。目前測定氨基甲酸酯類農藥殘留的方法有氣相色譜-質譜法[32]、液相色譜-質譜法[33]和液相色譜法[34]等。自從1977年Moye等首次采用液相色譜柱后衍生測定氨基甲酸酯類農藥殘留以來，利用液相色譜柱后水解或柱后衍生法對復雜介質中氨基甲酸酯類農藥的殘留量進行檢測越來越普遍。近年來多采用液相色譜柱后衍生技術，使氨基甲酸酯類農藥中的甲氨基團在堿液作用下生成的甲胺與衍生試劑反應生成強熒光物質，再用高靈敏度的熒光檢測儀器檢測。該方法具有選擇性高、基質干擾小的優點，是檢測氨基甲酸酯類農藥最有效、最靈敏的方法。使用最廣泛的衍生化試劑是鄰苯二甲醛和巰基乙醇，首先氨基甲酸酯類農藥在堿性條件下水解產生甲胺，甲胺再與鄰苯二甲醛、巰基乙醇反應生成強熒光物質，以熒光檢測儀器檢測，反應方程如圖3所示。于彥彬等[35]用液相色譜柱后衍生熒光法測定蔬菜和水果中的13種氨基甲酸酯類農藥，衍生化試劑為鄰苯二甲醛和巰基乙醇，發現當巰基乙醇和鄰苯二甲醛的體積比為10∶100時，熒光響應值達最大值，該方法相關系數大于0.994，保留時間的相對標準偏差為0.03%～0.22%，檢測下限為2.00～2.28 mg/kg。孫磊等[36]采用柱后衍生酸酯類農藥殘留，樣品用丙酮提取，經凝膠滲透色譜凈化，通過柱后衍生系統，最后用熒光檢測儀器測定，衍生化試劑為巰基乙醇和鄰苯二甲醛，該方法相對標準偏差為0.4%～7.0%，檢測限為0.01 mg/kg，具有靈敏度高、定性準確的優點。

另外，King等[37]將超臨界二氧化碳流體作為溶劑，把全氟丁酸酐、HFBA、嘧啶等衍生化劑溶解進行衍生化反應，氨基甲酸酯類農藥的衍生產物同時被提取到超臨界二氧化碳流體里面，進一步促進衍生化反應，具有非常高的靈敏性，并且消除有機溶劑在衍生化反應中的使用。孟凡立等[38]建立測定黃瓜、西紅柿及土壤中福美雙殘留的衍生化高效液相色譜法，首先福美雙在堿性EDTA-Na2溶液中降解，再用碘甲烷進行甲基化處理，最后用HPLC測定該甲基化產物。在黃瓜、西紅柿和土壤中福美雙的添加濃度在0.05～2.00 mg/kg，平均回收率分別為74.3%～93.9%、85.7%～102.0%和83.5%～101.8%，變異系數分別為0.7%～6.3%、1.8%～4.5%和1.6%～5.3%，均在農藥殘留測定所允許的范圍內，衍生化反應方程式如圖4所示。

6 衍生化技術在色譜法檢測其他農藥中的應用

在實際生產中還有很多農藥不屬于上述四類，在檢測中也會涉及到衍生化的問題。Yu等[39]同時檢測水中除草劑苯噻草胺及其代謝物，將標準多組分液用甲硅烷基衍生化試劑N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺（MSTFA）衍生，該方法回收率在78.6%～101.2%，相對標準偏差為3.2%～9.2%，準確度和精確度都較高。Díez等[40]用氣相色譜法檢測溴草腈等酸性除草劑，為提高酸性除草劑的揮發性，用三甲基氫氧化硫（TMSH）對其進行衍生化。第一步在高溫條件下將酸甲基化，第二步同樣條件下酯化。許行義等[41]以五氟芐基溴（PFB-Br）為衍生化試劑，檢測了水樣中的多菌靈組分，在分析結果的重現性、準確度和方法的檢出限方面，均獲得了非常滿意的結果。程永等[42]建立測定土壤中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的柱前衍生化高效液相色譜熒光測定方法，采用三氟乙酸酐（TFAA）-甲基咪唑（NMIM）-乙腈（ACN）作為衍生化試劑。總之，當在殘留檢測中需要衍生化處理，可根據農藥本身的化學結構及化學性質，選擇合適的衍生試劑進行反應。

7 小結

隨著越來越多農藥殘留問題的不斷出現，人們對檢測儀器和方法的要求也越來越高。色譜法作為現在最有效、最成熟的農藥殘留檢測方法是其他諸多方法不可替代的。單純的色譜法由于受到檢測儀器的限制，能夠檢測物質的種類是有限的，而衍生化技術可以很好地彌補這一缺點，只要通過合適的衍生化反應就可以把待檢物轉化為適合色譜法檢測的物質。顯著地擴大了被檢測物質的范圍，可避免一些昂貴儀器的購買，特別適合配備一般的氣相和液相色譜儀的實驗室和檢測監督機構使用。現有衍生化試劑種類不多，通用性不強，使用受到一定的限制。因此以后對衍生化技術的研究將會更加受到人們的重視，而且會向著以下的方向發展：①提高衍生化技術的靈敏度和準確度。由于衍生化的實質是化學反應，很難實現百分之百的轉化率，存在一定的誤差，要不斷地降低誤差，達到高靈敏度和準確度；②衍生化試劑具有通用性。現有的衍生化試劑通用性不強，一般只針對一種或一類待檢物，因此要開發通用性強的衍生化試劑；③操作簡單化。衍生化過程需要一定的設備，開發出更加先進的、專用的集成衍生化設備，可以使操作更加簡單、快速，提高檢測效率。

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