低溫干燥過程中LEA-motif對熱敏性藥物胰島素的活性保護研究

張 燕，李代禧，郭柏松，翟 振，劉 立，楊春生，余華星

(1.上海理工大學食品科學與工程研究所，上海 200093;2.上海東富龍科技股份有限公司凍干工藝研究室，上海 201108)

胚胎發育晚期豐富蛋白［1］(LEA)是植物胚胎發育后期種子中大量積累的富含甘氨酸、賴氨酸、組氨酸和其他親水氨基酸的一類蛋白質，因此，LEA蛋白具有很高的親水性以及熱穩定性［2］。LEA蛋白的無序性使其在干燥時，能適應熱敏性蛋白的形狀，吸附在蛋白表面，形成保護層，防止熱敏性蛋白的脫水變性、聚集變性和受熱變性［3-4］。

為了驗證LEA蛋白的保護性，我們選擇典型的熱敏性蛋白藥物——胰島素活性單體作研究對象，第3組 LEA蛋白(AaVLEA1)［5］的特征重復片段(LEA-motif，LEAM)作為保護劑，研究 LEA-motif對熱敏性蛋白藥物的干燥活性保護作用。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

豬胰島素，醫藥級;LEA蛋白特征重復片段(LT130325-LT342888，純度 95.47%);無水硫酸鈉、乙醇胺、磷酸均為分析純。

Waters e2695高效液相色譜儀;Waters e2695分離模塊和Waters2998光電二極管檢測器;LYO-0.2凍干機;XS205天平。

1.2 實驗方法

胰島素濃度為5 mg/mL，加入LEA-motif保護劑，其與胰島素六聚體的摩爾比分別為1∶0，1∶3(即LEA-motif與胰島素單體的摩爾比為 1∶0，1∶18)。

用凍干機進行冷凍干燥。首先將藥物在－45℃預凍 1 h。然后抽真空，一次干燥溫度－35℃，干燥室內真空度為0 Pa，干燥18 h。解析干燥溫度為25℃，直至干燥過程結束，這個過程共持續6 h。凍干結束后，用橡皮塞封玻璃瓶，保存在冰箱中。

1.3 分析方法

1.3.1 胰島素三維結構分析 胰島素采用蛋白質數據庫中的晶體結構(3inc［6］)作為初始結構，用Arguslab軟件構建其三維分子模型。

1.3.2 效價分析 HPLC法［7］用十八烷……