銅、鋅對細菌耐藥性有促進性作用

朱玨　黃逸強

降低動物對抗生素耐藥性問題。不僅需要從減少抗生素的應用著手，還要更進一步考慮豬飼料中鋅與銅應用（如種類及用量）的合理問題。

抗生素在豬日糧中的應用已長達幾十年了。自19世紀50年代以來，抗生素的促生長作用就已經被廣泛熟知。它不僅被用來治療動物疾病，而且還被用于提高動物生產性能。

抑菌劑（主要是抗生素）的全球應用量很大。如，1994年，丹麥動物養殖生產中抗生素的用量高達200噸，而其中超過一半以上，是被添加到飼料中用于促進動物生長。近幾年，隨著藥物耐藥問題的出現，使得抗生素使用一度成為敏感話題，最終導致歐洲各國禁止在動物養殖生產中禁止使用抗生素。

除了抗生素，一些其他飼料添加劑同樣具有抗菌和提高動物生產性能的作用，如在豬飼料中超劑量添加鋅（特別是氧化鋅）和銅（特別是硫酸銅）雖能夠改善腸道健康，但它們對細菌耐藥性有協同增效作用。

目前基本狀況

眾所周知，鋅元素是許多生物體需求的基本元素。其具有提高豬生產性能的積極性作用早已被人們所熟知。缺鋅會導致動物采食量下降、生長緩慢，且嚴重影響動物皮膚完整性（如角質化不全）。根據NRC豬營養飼養標準，根據豬的生長階段及體重，鋅需求量在50到100ppm之間。由于飼料中鋅含量偏低（或者有效鋅源含量不明確），需要額外供應補充鋅。在歐洲，單胃動物額外補充鋅用量最高是150ppm，但在一些國家，斷奶仔豬上使用藥理劑量鋅源（如氧化鋅）高達3000ppm。

與鋅元素一樣，銅也是許多生物機體所必需的微量元素。銅是許多動物體內酶的組成成分，并且也對動物生長有促進性作用。缺銅，動物機體會出現的癥狀包括：生長受阻、貧血、腿部畸形和發育不良等。雖然，豬對銅的需要量低（每公斤飼料干物質含銅量為4～10ppm），但飼料中還是會額外添加銅。在歐洲，仔豬飼料中銅的最大添加量為170ppm，其他生產階段豬銅的用量為25ppm。

此外，高劑量添加銅源（硫酸銅）到飼料中，能夠在動物腸道中對有害病菌起到有效抑制和殺滅效果。加上，畜牧養殖中藥物使用，兩者之間存存在協同性作用，使得病菌更容易產生耐藥性。這種耐藥性作用途徑及方式主要有以下幾種：

●膜蛋白轉運低，從而降低細胞膜滲透壓及通透性；

●產生酶，使藥物失活；

●抗生素結合位點修飾性作用，使得細胞靶器官改變；

●通過外排泵，將有毒元素外排出體外；

1995年，在丹麥，一種名為阿伏帕星的糖肽類抗生素，被用于動物促生長作用。當時，有21%對阿伏帕星（E.faecium）有抗性作用的屎腸球菌從豬體內分離出來。丹麥發現這些具有耐藥性細菌后，分別于1998年和1999年，在肥育豬和仔豬中禁止使用非醫療性抗生素。之后，于2006年，抗生素作為促生長劑被歐盟規定禁止使用。因為銅和鋅能夠調理腸道微生物，并且能降低斷奶仔豬腹瀉率功效，所以它們能夠取代部分抗生素。過量鋅和銅銅會對環境產生副作用，并且也類似于抗生素，能夠使環境中的細菌產生耐銅、耐鋅作用。為了研究抗生素與微量元素銅和鋅的關系。我們就細菌對金屬元素和抗生素的抗性作用，是否與金屬元素和抗生素之間具有強相關性作用進行了研究。

交叉耐藥性研究

耐藥性臨界值可以用交叉耐藥性來詮釋。這樣就能解釋單一基因型決定性因素導致了細菌對金屬元素和抗生素的抗性作用。例如，細菌也許能夠合成既能攜帶抗生素，又能攜帶金屬元素的轉運蛋白。在對鋅產生耐鋅細菌能夠通過外排泵，將細胞內多余鋅含量外排，降低細胞內鋅含量，從而保障細胞內外壓之間的恒定。同時，這種外排泵對鋅或其他分子也有特異性位點的接受作用。因此，這就是具有抗鋅作用細菌為什么能夠對一種或多種抗生素具有耐藥性作用的原因所在。

聯合耐藥性研究

耐藥性臨界值可以用聯合耐藥性來詮釋。一般而言，通過轉運因子（如質粒）能夠使得不同耐藥性基因發生在同一個遺傳組分。一些文獻研究中有涉及到金屬元素-抗生素相關的質粒表達。例如，金黃色葡萄球菌（S.aureus）的對鋅與甲氧西林抗性作用研究、屎腸桿菌（E.faecium）對銅與大環內酯和糖肽類抗性的相關性研究等，都表明了金屬元素與抗生素聯合使用能使受體細菌對它們產生耐性。

鋅

在金黃色葡萄球菌（S.aureus）中，對比對鎘與鋅具有抗性作用的基因片段--czrC。從不同國家對豬菌株研究發現：易感鋅菌株中發現存在czrC基因的僅有不到1%， 而95%czrC基因在對鋅具有抗性作用菌株中被發現。另外，該研究發現對鋅具有抗性作用菌株，同時也對甲氧西林有很強的抗性作用。對甲氧西林易感菌株，它們也都對氯化鋅易感；而對甲氧西林具有耐受作用菌株，超過90%菌株也對氯化鋅具有抗性作用，這說明對鋅和甲氧西林抗性作用具有相關性。

另外一個試驗表明：雖然丹麥豬體內并沒有沒有發現對甲氧西林易感菌株，但74%對甲氧西林具有抗性菌株，同樣也對鋅具有抗性作用。一般來講，對這些具有抗性作用的菌株對鋅的最低抑制濃度（MIC）是普通最低抑制濃度的4倍（對甲氧西林具有抗性作用的黃金色葡萄球菌的MIC是8mM，而對易感耐甲氧西林的黃金葡萄球菌的MIC僅2mM）。總之，選擇對鋅具有抗性作用的細菌，意味著其對藥物也會有抗性作用（圖1）。

在歐洲、加拿大和美國中西部地區出現過類似于對甲氧西林具有抗性作用的黃金葡萄球菌（MRSA），其主要作用基因片段名為克隆基因片段398，該基因片段是通過使用四環素和氧化鋅協同性作用促進生成的。這種菌株于近期在澳大利亞和新西蘭被發現。將該菌株（黃金葡萄球菌（MRSA）定植在豬鼻骨上，發現在使用氧化鋅和四環素實驗組豬對甲氧西林具的抗性作用的黃金葡萄球菌（MRSA）數量更高，且增殖速度非常快。在三周后，所有試驗中含有陰性MRSA菌株的豬，最終也因為感染陽性MRSA豬而呈現陽性反應。

銅

在銅的應用上面也出現了類似現象。銅可以使細菌對大環內酯類和糖肽類抗生素的抗性作用增強。能獲得對銅具有抗性作用的細菌一般是革蘭氏陰性菌，而革蘭氏陽性菌很少對銅有抗性作用。這跟tcrB基因（可轉讓的銅電阻同源CopB）有關。在對丹麥屎腸球菌（E.faecium）菌株研究中發現：這種基因出現與飼糧中銅水平有直接相關性。對銅有抗性作用菌株在豬菌株中很常見（49個菌株中有45個被發現）。同樣也在禽的菌株中非常常見（10/29），而在牛（5/32）、羊（0/22）以及人（3/29）身上發現這種耐受性菌株很少。在豬上面出現如此高的耐受性菌株也能夠解釋為：因養殖過程中使用了高銅而造成。因此，超過一半以上的豬菌株對大環內酯類具有耐藥性作用，并且幾乎四分之一的菌株對糖肽類具有耐藥性作用。

在這個研究中，所有對糖肽類具有耐受性菌株對大環內酯類和銅都耐受，并且對所有大環內酯類耐受性作用的菌株也對銅具有耐受性。其中僅有4株銅耐受菌株（組中低于10%）對抗生素易感。tcrB基因（可轉讓的銅電阻同源CopB）對銅有耐受性作用，而erm（B）對大環內酯類有抗性作用。這些都在豬菌株的同一質粒被發現。對糖肽類具有抗性作用基因也能物理性嫁接到tcrB基因上，而對其具有抗性作用。

另外，豬糞能夠做肥料，這些抗生素能夠通過糞便而轉移到土壤中。有研究表明土壤中細菌對抗生素的耐藥性和對銅的抗性作用有相關性作用。例如：在對銅耐受的細菌中出現對耐氨芐西林耐受性細菌出現率要比對銅易感的細菌要顯著性高。因此，耐銅細菌出現頻率是銅易感細菌的兩倍。

這些具有抗性作用細菌能通過動物和環境之間，在動物中快速廣泛的繁殖與分布。當銅和鋅選擇了這些具有抗性作用細菌，那么抗生素對他們的抑制及殺害作用會越來越小。這樣，這些具有雙重抗性作用細菌（對抗生素和金屬元素都有抗性作用）在動物之間、動物與環境之間的繁殖、感染與傳播水平感染與傳播就這么發生了。

抗性的傳播

此外，易感細菌也許能通過接觸這些抗性細菌從而變得具有抗性。這是因為微生物之間可能存在著基因物質的交換。耐受基因一般存在于基因轉運因子中，如質粒、轉位子等，這些能夠促成抗性作用通過水平感染而得以快速傳播。細菌通過結合的方式也許能夠接受其他細胞的質粒或轉位子。此外，它們也能通過將外源基因轉運方式嫁接到自己的基因組上。特別是DNA也許能夠通過噬菌體將抗性基因從一個細菌轉換到另外一個細菌上。之后，細菌開始通過細胞分裂將抗藥性基因片段轉運到它們的子細胞上。因此，高劑量應用銅和鋅會創造出對金屬元素和抗生素都具有抗性作用新一代細菌，這種抗性作用增強的細菌不僅會對動物健康造成威脅，還會通過水平與垂直傳播，使土壤中產生大量具有抗性作用細菌，從而使得環境安全與人類健康受到威脅。因此應該要合理選擇銅、鋅種類及適宜的應用劑量，從而構建動物、人類、環境之間的和諧。