JAK2/STAT4信號通路在運動所致大鼠Th1/Th2失衡中的作用

趙廣高++蘇全生++周石++蘇利強++張瑋

摘 要：通過游泳訓練誘發大鼠Th1/Th2失衡，觀察和分析JAK2/STAT4通路及其上游因子在該失衡發展過程中的變化規律，探討大運動量訓練導致Th1/Th2失衡的分子機制。將清潔級16周齡雄性SD大鼠隨機分為安靜對照組（C組）、游泳訓練組（T組），每組根據取材時間不同又隨機分為24 h組與7 d組。訓練采用4周遞增負荷游泳訓練方法。Western Blotting法測定心臟血淋巴細胞pJAK2、pSTAT4、JAK2、STAT4的蛋白表達，ELISA法檢測心臟血血漿IFN-γ、IL-4、IL-12值。結果發現：（1）T組大鼠血漿IFN-γ、IFN-γ/IL-4與IL-12（P<0.01）水平均顯著低于C組（P<0.01）、（P<0.05）。C組與T組大鼠血漿IL-12與IFN-γ的質量濃度顯著相關（P<0.01）。（2）T組大鼠血淋巴細胞pJAK2、pSTAT4蛋白表達均顯著低于C組（P<0.05）、（P<0.01）。結果說明4周遞增負荷訓練可能通過減少IL-12的分泌，抑制JAK2/STAT4信號通路中關鍵因子JAK2、STAT4的磷酸化過程，降低Th1類細胞因子IFN-γ的合成，誘發Th1/Th2失衡。

關 鍵 詞：運動生理學；Th1/Th2平衡；Janus激酶-2；信號傳導與轉錄激活因子-4；白細胞介素-12；γ-干擾素；白細胞介素-4

中圖分類號：G804.2 文獻標志碼：A 文章編號：1006-7116（2014）05-0139-06

Roles played by JAK2/ STAT4 signaling pathways in rats Th1/Th2

imbalance induced by exercising

ZHAO Guang-gao1，SU Quan-sheng2，ZHOU Shi3，SU Li-qiang4，ZHANG Wei4

（1.Department of Physical Education，Nanchang University，Nanchang 330031，China；

2.Chengdu Sport University，Chengdu 610041，China；3.School of Health and Human Sciences，

Southern Cross University，Lismore，NSW 2480，Australia；4.Division of Physical Education，

Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）

Abstract： By means of swimming training， the authors induced rats Th1/Th2 imbalance， observed and analyzed the patterns of changing of JAK2/STAT4 pathways and their upstream cytokines in the process of development of such an imbalance， so as to probe into the molecular mechanism of intensive training inducing the Th1/Th2 imbalance. The authors randomly divided 16-week old male SD rats graded clean into a calm control group （group C） and a swimming training group （group T）， then randomly divided each of these groups into a 24h group and a 7d group according to different sampling times， carried out the training by using the 4-week load progressively increased swimming training method， measured the protein expressions of pJAK2， pSTAT4， JAK2 and STAT4 in cardiac blood lymphocytes by using the western blotting method， measured the contents of IFN-γ， IL-4 and IL-12 in cardiac blood plasma by using the ELISA method， and revealed the following findings： 1） the levels of IFN-γ， IFN-γ/IL-4 and IL-12 in blood plasma of the rats in group T were all significantly lowered that those of the rats in group C （P<0.01， P<0.05， P<0.01）； the contents of IL-12 and IFN-γ in blood plasma of the rats in groups C and T were significantly correlative （P<0.01）； 2） the protein expressions of pJAK2 and pSTAT4 in blood lymphocytes of the rats in group T were all significantly lowered that those of the rats in group C （P<0.05， P<0.01）. The said findings indicate that the 4-week load progressively increased training may induce the Th1/Th2 imbalance by reducing the secretion of IL-12， suppressing the process of phosphorylation of key cytokines JAK2 and STAT4 in JAK2/STAT4 signaling pathways， and reducing the synthesis of type Th1 cytokine IFN-γ.endprint

Key words： sports physiology；Th1/Th2 balance；JAK2；STAT4；IL-12；IFN-γ；IL-4

過量運動引起的免疫失衡及其分子機制是目前研究的熱點問題[1]。作為反映細胞免疫與體液免疫平衡關系的重要指標，Th1/Th2平衡常用于評價運動中機體的免疫機能。現有的研究成果已基本闡明了Th1/Th2平衡在不同運動中的變化規律[1]，其中大運動量訓練對Th1反應的抑制作用也已由實驗研究所證實[2-4]。在此基礎上，研究者們參考了Th1/Th2平衡自身的調控因素，來研究大運動量訓練誘發Th1/Th2失衡過程中各種調節因素的作用[5-7]，試圖揭示該失衡發生的分子機制。

基礎研究認為，細胞因子介導的Janus激酶/信號傳導與轉錄激活因子（JAK/STAT）信號通路在Th1、Th2的分化過程中起決定性作用[8-10]。其中，白細胞介素（IL）-12介導的JAK2/STAT4通路誘導Th1分化，JAK2、STAT4的磷酸化是該通路激活的重要標志[11-12]。而大運動量訓練后Th1/Th2平衡的變化是否與JAK2/STAT4信號通路的狀態有關，目前尚需實驗予以證實。基于此，本研究采用長時間遞增負荷訓練的方法建立大鼠Th1反應抑制模型，探討JAK2/STAT4通路及其上游細胞因子在訓練中的變化特點及其與Th1反應的關系，旨在為運動免疫學相關理論的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級16周齡雄性SD大鼠32只，體重（456±38） g，飼養環境溫度18～25℃，相對濕度40%～60%，自然光照，自由飲食飲水。將大鼠隨機分為安靜對照組（C組，n=16只）、游泳訓練組（T組，n=16只）。T組又隨機分為末次訓練后24 h組（T1）與末次訓練后7 d組（T2）；C組也隨機分為C1、C2組，每小組各8只，分別與T1、T2組同時間段取材。

1.2 運動模型

大鼠購回適應性飼養3 d后，T組大鼠進行4周遞增負荷游泳訓練（第1周，10～90 min無負重；第2周，90～135 min無負重；第3周60～105 min，負重1%體重；第4周，105～180 min，負重1%體重），每周訓練5 d。前2周大鼠為無負重游泳，逐日遞增游泳時間，用以訓練大鼠的游泳水平，并逐漸提高其耐力。后兩周負重1%體重，游泳時間仍逐漸增加，時間增加的幅度根據大鼠每天訓練后的疲勞程度與第2天的活動狀態而定。負重為串有一定重量螺絲帽的鑰匙環，通過小皮筋綁定于大鼠雙上肢腋下。訓練期間未完成規定運動時間就出現動作明顯不協調、沉入水底后不能保持站立姿勢的大鼠，迅速撈起后用干毛巾擦干后休息5 min后，再放入水中游泳，并使之總游泳時間達到當日要求。

1.3 測試樣本的采集與處理

T組大鼠末次訓練后24 h、7 d根據體重用質量分數為10%的水合氯醛（0.0003 mL/g）腹腔注射麻醉并取心臟血。C1、C2組分別與T1、T2組同時間段取血。共取血2管，每管2.5 mL，均置于EDTA抗凝劑真空管中。一管靜置30 min后，3 000 r/min離心5 min，分離血漿用于檢測IFN-γ、IL-4、IL-12質量；另一管分離淋巴細胞，用于測定pJAK2、pSTAT4、JAK2、STAT4蛋白表達。

1.4 指標檢測方法

1）血漿IFN-γ、IL-4、IL-12質量濃度。

血漿細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-12含量均采用ABC-ELISA檢測。將抗大鼠細胞因子單抗包被在酶標板上，使標準品與樣品中的細胞因子和單抗結合，之后加入生物素化的抗大鼠細胞因子，形成免疫復合物連接于板上，用辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素與生物素結合，加入底物工作液后顯藍色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測光密度，細胞因子濃度和光密度值成正比，通過繪制標準曲線來求出標本中的細胞因子含量。所有檢測藥盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。

2）血淋巴細胞pJAK2、pSTAT4、JAK2、STAT4蛋白表達。

血淋巴細胞pJAK2、pSTAT4、JAK2、STAT4蛋白表達均采用Western Blotting法。提取后的淋巴細胞加入細胞裂解液，勻漿、超聲破碎并離心后取上清得總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。加5×SDS上樣緩沖液；10% SDS-PAGE分離蛋白樣品，恒流（30 mA）電泳，待Marker開始分離，轉為恒流（40 mA）電泳；將蛋白質分離轉移到NC膜上；90 V恒壓轉膜，90 min；室溫下將NC膜用5%脫脂牛奶（用TBST配制）封閉1 h；用兔抗JAK2（1︰800）、兔抗pJAK2（1︰500）、兔抗STAT4（1︰800）、兔抗pSTAT4（1︰500）或鼠抗β-actin抗體（1︰5 000） 4℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。之后進行化學發光、顯影、定影，并用凝膠圖象處理系統分析光密度值。所有檢測藥盒均由Cell Signaling公司提供，試劑β-actin-Mouse mAb由Sigma公司提供。

1.5 數據處理

實驗結果借助SPSS 17.0軟件進行統計處理。組間比較采用單變量方差分析（Univariate Analysis of Variance），首先檢測訓練效應和時相效應兩個主效應，之后對兩種因素的交互作用進行檢測（訓練×時相）。同時相不同組別與同組別不同時相間的差異水平用Bonferroni法進行多個比較的調整。兩種不同測試指標間的相關系數通過Pearson相關性來檢驗。顯著性差異水平設定為P<0.05，非常顯著性差異水平設定為P<0.01。

2 研究結果

2.1 血漿IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4與IL-12水平的變化endprint

主體間效應的檢驗顯示，訓練可導致大鼠血漿IFN-γ、IFN-γ/IL-4與IL-12水平均顯著低于C組（P<0.01、P<0.05、P<0.01），對大鼠血漿IL-4含量無顯著影響；4指標不同時相間均無顯著性變化（圖1）。此外，對4指標兩主效應間交互作用的檢驗也均未見顯著性差異。

從同時相不同組別間的比較來看，訓練后24 h與7 d血漿IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4與IL-12水平均分別低于安靜對照組同時相，其中訓練后24 h、7 d血漿IFN-γ質量濃度與訓練后7 d血漿 IL-12含量變化差異顯著。同組別不同時相間，訓練后7 d血漿IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4與IL-12水平均低于訓練后24 h時相（P>0.05）（見圖1）。

T組與C組比較：1）P<0.05；2）P<0.01

圖1 T組與C組血漿IFN-γ、IL-4、IL-12質量濃度及IFN-γ/IL-4值的比較

2.2 血漿IL-12與IFN-γ含量的相關性

從Pearson相關性檢驗結果來看，統計范圍為全部大鼠的血漿IL-12與IFN-γ的質量濃度顯著相關（r=0.907，P<0.01），統計范圍為兩安靜對照組大鼠的兩指標質量濃度也顯著相關（r=0.913，P<0.01），統計范圍為兩訓練組大鼠的兩指標質量濃度同樣呈顯著相關（r=0.857，P<0.01）。

2.3 大鼠血淋巴細胞JAK2、pJAK2、STAT4、pSTAT4水平的變化

從主體間效應的檢驗結果來看，訓練可導致血淋巴細胞pJAK2與pSTAT4蛋白表達顯著下調（P<0.05、P<0.01），對JAK2與STAT4無顯著性影響；4指標不同時相間均無顯著性變化（見圖2）。此外，對4指標兩主效應間交互作用的檢驗也均未見顯著性差異。

在同時相不同組別間的比較上，訓練后24 h與7 d血淋巴細胞pJAK2與pSTAT4蛋白表達均低于安靜對照組同時相，其中訓練后7 d血淋巴細胞pSTAT4表達變化差異顯著。同組別不同時相間，訓練后7 d血淋巴細胞pJAK2與pSTAT4蛋白表達水平低于訓練后24 h時相，但未呈現顯著性差異（見圖2）。

T組與C組比較：1）P<0.05，2）P<0.01

圖2 T組與C組血淋巴細胞JAK2、pJAK2、STAT4、pSTAT蛋白表達的比較

3 討論

3.1 訓練對Th1/Th2平衡的影響

長周期、大運動量訓練可導致受試機體脾臟或外周血淋巴細胞中Th1細胞數量、Th1細胞分泌IFN-γ的水平或外周血IFN-γ含量顯著降低，引起Th1反應抑制，誘發Th1/Th2失衡[2-4]。在Th1/Th2平衡的評價方法中，外周血細胞因子IFN-γ、IL-4含量也已被許多學者在運動科學研究中逐漸采用[4，13]。本研究結果顯示，4周遞增負荷訓練可引起大鼠血漿IFN-γ質量濃度顯著降低（P<0.01）（見圖1），提示本實驗訓練方案可有效抑制Th1反應，導致細胞免疫功能低下。比較訓練后兩個取材時相的實驗結果發現，訓練后7 d血漿IFN-γ質量濃度低于訓練后24 h時相，比安靜對照組的抑制作用也更為顯著，提示Th1反應的抑制作用在訓練之后的一段時間內呈加重趨勢，該實驗結果與Wang Ru等[3]的研究結果相一致。

為了更直觀地反映運動過程中的Th1/Th2平衡，有學者將運動前后Th1、Th2細胞數量的比例或IFN-γ、IL-4含量的比值（或IFN-γ mRNA/IL-4 mRNA值）作為Th1/Th2平衡的一個評價指標[4，14-15]。本研究測定了4周遞增負荷訓練后血漿IFN-γ/IL-4比值的變化情況，結果發現，訓練可引起大鼠血漿IFN-γ/IL-4值顯著降低（P<0.05），與蘇利強等[4]的研究結果相一致。而訓練后7 d IFN-γ/IL-4值則低于訓練后24 h時相（見圖1）。該結果進一步說明4周遞增負荷訓練可導致Th1型免疫反應抑制為主的Th1/Th2失衡，該失衡在訓練后24 h至7 d階段呈加重的趨勢。

3.2 訓練對IL-12介導的JAK2/STAT4通路的影響

在Th細胞分化的過程中，細胞因子啟動的JAK/STAT信號通路的狀態起關鍵作用。其中，IL-12啟動的JAK2/STAT4通路介導Th1細胞分化[116]。IL-12主要由抗原提呈細胞（APC）中的樹突狀細胞分泌，是啟動Th1細胞分化過程的關鍵細胞因子[17]。研究表明，當用抗IL-12的抗血清耗盡IL-12或基因敲除IL-12時，Th1細胞的分化便受到抑制[18]。JAK2/STAT4信號通路歸屬于非受體酪氨酸激酶信號通路，是細胞因子IL-12誘導Th1細胞分化過程中非常重要的傳導途徑。其中，JAK2是一種胞質內的非受體型可溶性酪氨酸蛋白激酶，是JAK的家族成員之一。研究表明，JAK2缺失細胞不能表達Th1類細胞因子IFN-γ[19]。STAT4歸屬于一種能與靶基因調控區DNA結合的胞漿蛋白家族——STAT。當STAT4基因被敲除時，小鼠會發生Th1細胞生成障礙與Th1細胞缺陷的臨床表現[20]。

目前，運動科學領域中對IL-12與Th1/Th2平衡關系的研究還不多見。西班牙學者Giraldo等[21]發現，無論是在55%VO2max強度下持續45 min，還是在70%VO2max強度下持續1 h的自行車運動后，健康女性外周血血清IL-12與IFN-γ的含量在運動后即刻與24 h的變化趨勢均相一致。美國學者Kohut等[22]發現，一次遞增跑臺速度至力竭的運動后，對實驗小鼠施加HSV-1病毒感染，病毒感染2 d后小鼠脾細胞分泌的IL-12與IFN-γ均顯著降低；感染7 d后IL-12仍顯著低于對照組，體現了它對Th1分化抑制的長效性，但IFN-γ恢復至安靜組水平，其原因尚不清楚。此外，日本學者Suzuki等[23]測定了力竭運動后運動員血漿細胞因子含量的變化。結果發現，作為IL-12的拮抗劑[24]，血漿IL-12p40在運動后顯著升高，而IFN-γ活性下降，但血漿IL-12的含量在實驗中未檢出。目前尚未見長時間運動訓練干預機體IL-12的實驗報道。endprint

運動條件下Th1/Th2平衡與JAK2/STAT4信號通路關系方面，目前未見到JAK2測定的相關實驗報道。STAT4方面，研究者將分別誘導Th1和Th2應答的轉錄因子STAT4和GATA3作為一對指標，用PCR實驗技術探討了9周遞增負荷運動過程中大鼠外周血白細胞STAT4 mRNA、GATA3 mRNA表達量的變化情況[7]。結果發現，9周訓練后大鼠STAT4/GATA3顯著低于對照組同時相，而1周的中等強度運動后大鼠STAT4/GATA3高于對照組同時相，且STAT4/GATA3與IFN-γ/IL-4的變化趨勢相一致。然而，STAT4 mRNA指標本身的變化情況文獻并未報道。

本研究在測定血漿IFN-γ質量濃度的同時，測定了同一血樣血漿IL-12質量濃度量與血淋巴細胞pJAK2、pSTAT4表達的變化情況。結果發現，4周遞增負荷訓練可導致大鼠血漿IL-12含量顯著降低（P<0.01），訓練后7 d血漿IL-12質量濃度量低于訓練后24 h時相（見圖1）。且各實驗大鼠血漿IL-12與IFN-γ的質量濃度顯著相關（r=0.907，P<0.01）。此外，訓練還導致了血淋巴細胞pJAK2與pSTAT4蛋白表達顯著下調，而訓練后7 d血淋巴細胞pJAK2與pSTAT4的蛋白表達水平均低于訓練后24 h時相（圖2）。以上結果提示：4周遞增負荷訓練可能影響了APC細胞的分泌作用，導致IL-12生成減少。在與Th1細胞細胞膜上IL-12R發生作用時，不能提供充足的p35來結合IL-12R2，一定程度上抑制了JAK2相互聚集，并通過交互自身磷酸化作用而活化的反應過程。同時，IL-12R上的酪氨酸殘基的磷酸化作用也減弱，無法為STAT4提供足夠的停泊位點。在這樣的內環境中，STAT4羥基酪氨酸磷酸化而激活為pSTAT4的作用受到抑制。由pSTAT4單體聚合形成的、用于穿越核膜識別其特異的DNA上的靶序列、啟動IFN-γ mRNA轉錄的pSTAT4同源二聚體也生成減少（見圖3）。因此，Th1細胞合成IFN-γ的能力相對降低，分泌到血漿中的IFN-γ質量濃度也顯著下降。訓練對這一過程的抑制作用可以持續到末次訓練后7 d。需要指出的是，本研究盡管為JAK2/STAT4通路及其上游因子在運動中Th1/Th2失衡的作用機制提供了實驗依據，但仍存在著不足之處：如研究中缺乏Th1細胞功能抑制的直接證據——Th1細胞分泌IFN-γ的水平與IFN-γ mRNA表達的變化指標，這也將是我們下一步研究需要解決的問題之一。

Y代表酪氨酸殘基，P代表磷酸化過程，↓代表顯著降低，

-代表抑制作用

圖3 4周遞增負荷訓練后JAK2/STAT4通路及

上游細胞因子的變化

此外，本研究還測定了各組大鼠血淋巴細胞JAK2、STAT4的表達情況。結果發現，4周遞增負荷訓練對血淋巴細胞JAK2與STAT4蛋白表達并無顯著影響（見圖2）。由此可見，訓練對JAK2與STAT4的表達影響不大，主要通過抑制其磷酸化過程，來抑制JAK2/STAT4信號通路的作用。

4周遞增負荷訓練可有效抑制大鼠Th1免疫反應，誘發Th1/Th2平衡向Th2方向漂移，導致免疫失衡。該失衡作用可在訓練后維持一段時間。

4周遞增負荷訓練可能通過減少大鼠Th1細胞啟動因子IL-12的分泌，抑制JAK2/STAT4信號通路中關鍵因子JAK2、STAT4的磷酸化過程，降低Th1類細胞因子IFN-γ的合成。IL-12介導的JAK2/STAT4通路的抑制可能是大運動量訓練導致Th1/Th2失衡的分子機制之一。

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