哮喘小鼠肺組織中IL－17及IL－17受體的變化

劉曉丹 張 晗 尚云曉

1 遼寧省沈陽市兒童醫(yī)院內(nèi)科 110032； 2 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科

近年來兒童哮喘的發(fā)病機制和治療方法越來越被人們所關(guān)注。支氣管哮喘是多種炎性細胞和炎癥因子相互作用而形成的慢性呼吸道炎癥性疾病。哮喘的核心是氣道高反應(yīng)性，其本質(zhì)是呼吸道慢性炎癥，以嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等通過釋放炎癥因子和細胞因子而起主要作用。但目前哮喘確切的發(fā)病機制尚不明確，許多臨床及實驗研究表明，IL－17與哮喘關(guān)系密切。白細胞介素－17（interleukin17，IL－17）是由一種新型的不同于Th1型和Th2型的CD4＋效應(yīng)T 細胞－Th17 細胞亞群特異性產(chǎn)生［1，2］，IL－17是一個N末端信號肽含有155個氨基酸的糖蛋白，由二硫鍵連接的同源二聚體組成，在C末端區(qū)域有5個空間上保守的半胱氨酸殘基，形成IL－17家族典型的半胱氨酸結(jié)節(jié)。在人類和小鼠中至少存在6個IL－17家族成員的配體（IL－17A～F）和5個受體（IL－17RA～D 和SEF）［3］。IL－17可以通過促進釋放前炎癥細胞因子來放大炎癥反應(yīng)，具有強大的招募中性粒細胞的作用，可促進IL－6、IL－8、粒細胞集落刺激因子以及前列腺素E2等細胞因子釋放，促進大量黏液分泌，增加氣道高反應(yīng)性，與哮喘等氣道炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。

本實驗采用哮喘模型為研究對象，動態(tài)觀察不同時間IL－17及IL－17受體的動態(tài)表達。旨在探討哮喘小鼠肺組織中IL－17及IL－17受體的變化趨勢，為進一步深入研究哮喘的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料 BALB／c小鼠64只，周齡4周，體重16～20g，中國醫(yī)科大學(xué)中心實驗室動物部提供；小鼠IL－17及IL－17受體ELISA試劑盒購自美國R＆D公司；卵蛋白購自美國Sigma公司；氫氧化鋁粉劑購自沈陽化工三廠。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型制作。選用4周齡的BALB／c小鼠64只，雌雄各半，分為哮喘組32只、正常對照組32只，置于SPF級清潔動物室，在標(biāo)準(zhǔn)條件下分籠飼養(yǎng)。哮喘組第1天小鼠腹腔注射20μg卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）和2mg氫氧化鋁（混于0.5ml磷酸鹽緩沖液中）致敏，再分別于第8、15、22天予每只小鼠腹腔注射10μg OVA和1mg氫氧化鋁（混于0.5ml磷酸鹽緩沖液中），于第23～29天每日應(yīng)用4%OVA霧化吸入1次，25～30min／次至喘息發(fā)作，小鼠表現(xiàn)為煩躁不安、頭面部瘙癢、抓耳撓腮、呼吸急促、弓背等。

1.2.2 肺組織勻漿及肺泡灌洗液的采集。兩組小鼠于造模后第3、7、14、21天4個時間點進行取材，每個時間點取8只。首先注射10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后將小鼠仰臥位固定，常規(guī)碘酒、酒精消毒頸部及胸部，以無菌專用器械（0.1%的DEPC浸泡24h，高壓滅菌）操作。打開胸腔，分離頸部氣管，結(jié)扎右主支氣管，注入0.5ml PBS溶液進行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)3次。收集肺泡灌洗液（回收 率 ＞80% 為 合 格），4℃ 離 心 （3 000r／min，15min），取上清－80℃冰箱保存。取左肺組織，切割標(biāo)本后，稱取重量，加入一定量的PBS，用液氮迅速冷凍。其后標(biāo)本融化后仍然保持2～8℃的溫度，加入一定量的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20min（2 000～3 000r／min），收集上清，于EP管中－80℃冰凍保存。

1.2.3 IL－17及IL－17受體含量的 ELISA 檢測。將肺泡灌洗液及肺組織勻漿按酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒說明書進行操作，最后使用BIORAD酶標(biāo)儀測量450nm處波長吸光度（OD值）檢測IL－17及IL－17R的含量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗或三組以上比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD檢驗；方差不齊時采用Dunnett T3檢驗。P＜0.05為差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘組與正常組小鼠肺泡灌洗液中IL－17含量比較 哮喘組較正常組各時間點肺泡灌洗液（BALF）IL－17含量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。哮喘組BALF中IL－17含量在第7天達到高峰，其后IL－17含量逐漸下降（見表1）。

表1 肺泡灌洗液中IL－17的含量（±s，n＝8，pg／ml）

表1 肺泡灌洗液中IL－17的含量（±s，n＝8，pg／ml）

注：與正常組比較＊P＜0.05。

分組 3d 7d 14d 21d哮喘組 66.54±5.07＊ 86.14±3.51＊ 76.65±2.60＊ 66.07±3.97＊正常組 45.76±2.65 44.59±2.77 42.68±3.4844.23±2.69

2.2 哮喘組與正常組小鼠肺組織勻漿中IL－17受體含量比較 哮喘組較正常組各時間點肺組織勻漿中IL－17R含量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。IL－17R含量在第7天達到高峰，其后IL－17R含量逐漸下降（見表2）。

表2 肺組織勻漿中IL－17R的含量（±s，n＝8，pg／ml）

表2 肺組織勻漿中IL－17R的含量（±s，n＝8，pg／ml）

注：與正常組比較＊P＜0.05。

分組 3d 7d 14d 21d哮喘組 53.49±3.19＊ 64.77±4.37＊ 58.21±2.61＊ 54.06±3.63＊正常組 35.14±5.47 38.02±3.10 35.19±4.5737.61±4.15

3 討論

支氣管哮喘是由各種抗原和化學(xué)刺激物所引起的慢性氣道炎癥，是炎癥細胞浸潤、炎癥介質(zhì)和細胞因子相互作用參與的過程，其發(fā)病率逐年增高，但目前哮喘確切的發(fā)病機制尚不明確。最近研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的肺組織，支氣管肺泡灌洗液及痰液中IL－17顯著升高，而且與氣道高反應(yīng)性的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［4～6］。馬超等研究也顯示，IL－17表達水平隨哮喘病情加重而升高，IL－17可促進中性粒細胞活化、趨化及募集，參與哮喘的發(fā)生［7］。IL－17與中性粒細胞的增殖、成熟和趨化密切相關(guān)［8］，還能通過IL－8等途徑對中性粒細胞產(chǎn)生趨化和活化作用［9］。國外有研究顯示，哮喘小鼠氣道黏膜有Th17浸潤［10］，Th17主要的效應(yīng)因子IL－17對炎性細胞有強大的化學(xué)趨化作用，可以顯著增加中性粒細胞在呼吸道內(nèi)局部浸潤，并通過中性粒細胞在哮喘的炎癥形成及氣道重塑中發(fā)揮作用。在哮喘中IL－17可通過誘導(dǎo)上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等分泌IL－6、IL－8及前列腺素E2等，與成纖維細胞一起促進CD34＋細胞增殖、分化為成熟中性粒細胞［11］。研究表明，IL－17受體缺陷小鼠肺內(nèi)的中性粒細胞減少，而IL－17過度表達可通過誘導(dǎo)巨噬細胞炎性蛋白－2和G－CSF的產(chǎn)生介導(dǎo)中性粒細胞聚集［12］，刺激相關(guān)細胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生［13，14］。IL－17誘導(dǎo)巨噬細胞、支氣管成纖維細胞、支氣管上皮細胞等釋放IL－6、GM－CSF、腫瘤壞死因子（TNF－丫）、單核細胞趨化蛋白－1、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）等促進炎癥細胞的聚集及造成炎癥損傷［15］。IL－17也可促進杯狀細胞增生，增加黏蛋白表達，形成黏液栓參與哮喘的發(fā)生［16］。

本研究建立了哮喘小鼠模型，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測小鼠肺組織中IL－17及IL－17受體的含量，結(jié)果顯示哮喘組各時間點IL－17及IL－17受體含量較正常組明顯升高，且在造模后第7天哮喘組中IL－17及IL－17受體含量達到最高。本實驗結(jié)果顯示IL－17及IL－17受體含量隨著造模時間的延長呈先增高后降低的趨勢，可能是參與支氣管哮喘急性發(fā)作的主要細胞因子之一，但具體相關(guān)作用機制有待于進一步研究。

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