高效液相色譜法測定血漿中烏頭堿的含量

曹海瑩

黑龍江省慶安縣公安局，黑龍江 慶安 152400

烏頭類中藥因其具有治療風濕痹證、跌打損傷等顯著療效，被廣泛應用于中醫臨床。川烏、草烏和雪上一支蒿等烏頭屬中草藥均含有烏頭堿類成分［1-2］，既是烏頭類中藥的有效成分又是毒性成分，其安全范圍窄，治療量與中毒量接近，同時由于患者的個體差異，對其耐受性不一，常引起誤服中毒或投毒［3-4］。由于烏頭堿中毒無特異性臨床表現，難以對其進行中毒鑒別，建立血漿中烏頭堿的測定方法對法醫鑒定及臨床診斷具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日本島津高效液相色譜儀 (LC-6A泵，SCL-6B系統控制箱，Anastar色譜工作站);離心機(SANYO);YKH-1型液體快速混合器;PB153-S型電子分析天平 (瑞典梅特勒-托利多)。

1.2 藥品與試劑 烏頭堿標準品 (批號:110720-200410，中國藥品生物制品檢定所提供);乙晴為色譜純，水為雙蒸水。其余試劑均為分析純。

2 方法及結果

2.1 血液樣品的前處理 在經志愿者同意后，采取靜脈血2ml置于離心管中，3000r/min離心，取血漿 0.5ml加0.5ml氨水混勻后加入4ml乙醚震蕩萃取，提取10min后置于離心機上3000r/min離心5min，吸取上清液3ml于試管中，用N2吹干后加入0.4ml甲醇備用。

2.2 色譜條件 色譜分離柱:Hypersil ODS2(4.6mm，200mm);流動相:0.005mol/L溴化四丁銨:乙晴=65∶35(v/v);檢測波長:235nm;流速:1ml/min;進樣量:20μl;柱溫:32℃。

2.3 實驗溶液的配制 精密稱取烏頭堿標準品1000μg，置于2ml容量瓶中，加入純凈水定容，精密配制成為500μg/ml的烏頭堿標準溶液備用。0.005mol/L溴化四丁銨水溶液。

2.4 標準曲線 按照參考文獻將烏頭堿對照品配制成0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μg/ml 不同濃度溶液，按上述色譜條件測定，以色譜峰面積與血漿濃度計算線性回歸方程，即Y=190354X+69984，其相關系數r=0.9997，線性范圍 0.1-5.0μg/ml。

2.5 精密度實驗 將配置的 0.2、0.8、3.2μg/ml的烏頭堿溶液，按本文所述條件檢測，連續監測6次，以烏頭堿色譜峰面積計算其RSD為0.19%。

2.6 穩定性實驗 將配置的0.8μg/ml的烏頭堿溶液按本文所述條件檢測，每間隔2h檢測一次，其RSD為0.68%，12h內穩定。

2.7 回收率實驗 取0.2μg/ml的烏頭堿溶液3份，每份分別加對照溶液，以烏頭堿色譜峰面積計算其平均回收率，去其平均回收率為98.8%。

2.8 樣品測定 取口服附子藥酒及服用含附子中藥的志愿者的血漿100μl，共3批次，每個樣品測定3次，按本文所述條件方法測定色譜峰面積，測得樣品中烏頭堿的含量見表1。

3 應用案例

死者男性，63歲。連續飲用自制高濃度藥酒，每次四兩左右，約30min后相繼發生口、唇、舌、四肢發麻等癥狀，經搶救無效后死亡。法醫尸檢提取死者血漿和所引藥酒送檢，采用上述HPLC法進行測定，所飲藥酒和死者血漿中均檢出烏頭堿成分。死者血漿中烏頭堿濃度為0.22μg/ml，藥酒中烏頭堿濃度為 53.2μg/ml。死者飲用該藥酒在200ml以上，實際攝入烏頭堿的量已大于1.064×104μg，超出成人口服烏頭堿致死量，本案應系烏頭堿急性中毒死亡。

表1 樣品測定結果

4 討論

含有烏頭堿的中藥在中醫臨床中大量應用，由于其毒性較強，常有烏頭堿中毒的事件發生。本文對采自口服附子藥酒及口服含有附子的中藥湯劑的志愿者的血清進行烏頭堿檢測，檢測結果具有烏頭堿檢出，雖低于烏頭堿中毒劑量，但其如長期服用烏頭堿在體內蓄積很可能引發其中毒。通過本文研究建議人們不要擅自服用含烏頭堿的藥酒或湯劑，必須服用時要在專業醫生的指導下進行，并隨時觀察身體反應，如有不適及時就醫，防止其中毒發生［5-6］。文獻報道高效液相色譜法檢測烏頭堿，其準確度、精密度和萃取回收率上都達到了生物分析的要求，能滿足法醫毒物分析［7-8］。該分析方法血漿用量少，樣品處理方法簡單，減少了烏頭的分解和損失環節，提高了檢出率。若待測血中烏頭堿含量較低時，可通過增大取樣量或減小定容體積等手段來富集。

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［7］郭丹，林靜瑜，周春權.高效液相色譜法測定家兔血漿中的烏頭堿濃度［J］.海峽藥學，2011，23(12):32-34.

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