hMDHⅡ過表達抑制過氧化氫壓力下的CHO細胞凋亡

靖 鈺，張存超，付 托，蔣 成，張學光，寇 庚

（1.蘇州大學 醫學生物技術研究所，江蘇 蘇州215007；2.第二軍醫大學 腫瘤研究所，上海200433）

中國倉鼠卵巢細胞（CHO）是表達單克隆抗體最常用的工程細胞，凋亡是CHO細胞培養過程中細胞死亡的主要方式，限制了細胞密度和蛋白表達量的提高。細胞凋亡又稱細胞的程序性死亡，是細胞在多種因素誘導下的自殺行為，其途徑分為外在途徑、線粒體途徑和內質網途徑[1］。其中線粒體途徑由應激條件、化學治療試劑和藥物所啟動。

活性氧（ROS）是一類氧衍生的自由基的總稱，通常包括氧離子、過氧化物和自由基等，可通過線粒體途徑誘導細胞凋亡[2］，是細胞凋亡的重要誘導因素。因此，通過降低活性氧可以減少細胞凋亡，如TIGAR過表達可降低細胞內活性氧水平[3］，進而減少凋亡。

人蘋果酸脫氫酶Ⅱ（human malate dehydrogenaseⅡ，hMDHⅡ）位于線粒體內，是TCA循環中的一種酶，可以將蘋果酸轉化為草酰乙酸。研究顯示，在CHO細胞中過表達hMDHⅡ能提高細胞內ATP和NADH水平，并增大活細胞密度[4］，但缺乏此基因過表達對細胞凋亡影響的研究。

作者以CHO－K1細胞為研究對象，考察hMDHⅡ過表達對活性氧誘導CHO細胞凋亡的影響，擬為理解活性氧誘導的細胞凋亡提供理論支持，為抗凋亡細胞株構建提供新的途徑。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

CHO－K1細胞、E.coli TG1，自行保存。

限制性內切酶（Takara Code：DRR037A），Takara公司；DNA片段小量膠回收試劑盒（W5001）、質粒小量抽提試劑盒（W5211），上海生工生物技術公司；RNA提取試劑（No.740955.50），Macherey－Nagel公司；DNA marker，天根生化科技北京有限公司；淋巴細胞分離液，上海華精生物高科技有限公司；PCR、反轉錄試劑及DNA連接試劑盒，Promega公司；轉染試劑盒lipofectamine 2000，Invitrogen公司；G418試劑，Roche公司；JC－1線粒體膜電位檢測試劑盒，碧云天生物技術研究所；DCFH－DA試劑，Sigma公司。

ABI 7500型 Real－time PCR 儀，Applied Biosystems公司；BD FACSCALIBUR型流式細胞儀，BD Bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 hMDHⅡ基因克隆及表達載體構建

hMDHⅡ的編碼序列（NM＿005918.2）長度為1 017 bp。為此序列設計并合成PCR引物（上海生工生物技術 公 司），F：CCCAAGCTTGCCACCATGCTCTCCGCCCTCGCCCG，R：CGGAATTCTCACTTCAGGGGTCTTCACGAA。分別在此引物對中添加HinDⅢ和EcoRⅠ酶切位點。

從人血液淋巴細胞中提取mRNA并反轉錄獲得cDNA，以此作為PCR模板，進行PCR擴增（退火溫度為50℃，30s，35個循環），PCR產物長度為1 045bp。將PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行分離并鑒定，判定并切割目的條帶進行膠回收，用于后續與克隆載體連接。

以pGEM－T作為克隆載體，將膠回收產物與其連接，通過轉化、涂布平板、挑取克隆、測序等步驟獲得含有正確hMDHⅡ序列（用于后續表達載體構建）的克隆載體。以pcDNA3.0作為表達載體，經HinD Ⅲ和EcoRⅠ酶切后與同樣經相同酶酶切后的hMDHⅡ序列連接，經過與上述克隆載體構建相同的步驟獲得表達載體，測序確認其序列。

1.2.2 轉染與篩選及熒光定量PCR鑒定[5］

用含有hMDHⅡ的pcDNA3.0表達載體轉染CHO－K1細胞，轉染使用lipofectamine 2000試劑，以800μg·mL－1G418作為篩選壓力，獲得G418抗性細胞。用有限稀釋法篩選這些抗性細胞獲得單克隆，并用 Real－time PCR法鑒定所獲得的克隆。以β－actin基因作內參，其PCR引物參照文獻[6］。hMDHⅡ進行熒光定量PCR的引物為：F：AGAAAGCCAGGCATGACCCG，R：TGTGATGGGGATGGTGGAATTA。PCR采用兩步法，退火／延伸溫度為60℃，35s，40個循環。

1.2.3 細胞培養

直接更換經鑒定的hMDHⅡ陽性克隆的培養基為CHOM－B01＋4mmol·L－1Gln，待細胞懸浮后，轉移至100mL搖瓶培養，初始接種密度為5×105個·mL－1，裝液量為30mL，細胞每3d傳代1次。

補料分批培養時，基礎培養基為CHOM－B01＋4 mmol·L－1Gln，并添加自主開發的流加培養基。初始接種密度為5×105個·mL－1，裝液量為30mL。

1.2.4 細胞凋亡檢測

使用JC－1檢測線粒體膜電位，線粒體膜電位的缺失可用于指示細胞凋亡：線粒體膜電位較高時，JC－1在線粒體的基質中以聚合物形式存在，此時產生紅色熒光；而線粒體膜電位較低時，JC－1因不能在線粒體中聚集而以單體形式存在，此時產生綠色熒光。具體操作如下[7］：取1×105～6×105個細胞，重懸于0.5 mL無血清培養基中，加入 0.5mL JC－1（5mg·mL－1）染色工作液，顛倒數次混勻，在細胞培養箱中37℃孵育20min后，4℃、600g離心3～4min，沉淀細胞。棄上清，細胞用PBS緩沖溶液洗滌2次。用500μL PBS緩沖溶液重懸后，用流式細胞儀檢測，用488nm光激發并在530nm和575nm波長處收集信號，以熒光強度比（綠光／紅光）表征線粒體膜的去極化情況。

對于大多數細胞，通常10μmol·L－1羰基氰化氯苯 腙 （carbonyl cyanide 3－chlorophenylhydrazone，CCCP）處理20min后線粒體的膜電位會完全喪失，經JC－1染色后觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經JC－1染色后應顯示紅色熒光。因此，兩者分別用作陽性對照和陰性對照。

1.2.5 活性氧檢測

取1×106個細胞離心后用1mL新鮮無血清培養基重懸，置于24孔板中，加入10μL 10μmol·L－1DCFH－DA試劑。置于培養箱中37℃避光孵育30 min，期間每隔3～5min輕輕搖晃24孔板，使得細胞與DCFH－DA探針充分結合。取上述1mL細胞液以1 000r· min－1離心5min，棄上清并用預冷PBS緩沖溶液洗滌，最終重懸于500μL PBS緩沖溶液中。用流式細胞儀在激發光488nm、發射光525nm處檢測。

2 結果與討論

2.1 hMDHⅡ基因克隆及表達載體的構建

以人淋巴細胞cDNA為模板，使用hMDHⅡ基因克隆引物進行PCR擴增，產物的凝膠電泳鑒定如圖1所示。

圖1 hMDHⅡ基因PCR產物電泳鑒定Fig.1 Electrophoresis identification of hMDHⅡgene PCR product

從圖1可見，在約1 000bp位置有一條明亮的條帶，將此條帶膠回收后與pGEM－T載體連接并轉化至E.coli TG1感受態細胞，隨后挑選5個克隆用于測序，依次編號為1＃～5＃。測序結果表明，5＃克隆中hMDHⅡ序列與目的序列一致。將hMDHⅡ－pGEMT 5＃質粒，按1.2.1方法制備成表達載體，命名為hMDHⅡ－pcDNA3.0，此載體序列經DNA測序確認無誤。

2.2 hMDHⅡ的mRNA水平鑒定

將hMDHⅡ－pcDNA3.0和pcDNA3.0載體分別轉染CHO－K1細胞，用有限稀釋法篩選獲得6株具有G418抗性的穩定單克隆，依次編號為1＃～6＃。分別從這些克隆中提取總RNA并反轉錄獲得cDNA，以此為模板用熒光定量PCR法鑒定hMDHⅡ的表達。結果顯示，編號為2＃、3＃和6＃的克隆均表達hMDHⅡ，并且6＃克隆hMDHⅡ表達量最高（圖2）。取hMDHⅡ表達量最高的6＃克隆用于后續實驗。

圖2 Real－time PCR鑒定hMDHⅡ基因表達Fig.2 Relative hMDHⅡ mRNA quantity determined by Real－time PCR

2.3 hMDHⅡ過表達抑制活性氧壓力下的CHO細胞凋亡

以6＃克隆為研究對象，考察hMDHⅡ過表達對CHO細胞活率的影響，同時，為考察活性氧對細胞的影響，在補料分批培養第5d向細胞培養物中添加過氧化氫以模擬活性氧條件，結果見圖3。

圖3 hMDHⅡ過表達對過氧化氫壓力下的CHO細胞活率的影響Fig.3 Effect of over－expression of hMDHⅡon survival rate of CHO cell under the condition of hydrogen peroxide treatment

從圖3可見，添加0.1mmol·L－1過氧化氫之后，CHO細胞的活率逐漸下降；在補料分批培養第9d、10 d，hMDHⅡ6＃細胞的活率顯著高于對照組，尤其是第10d時兩者差異更為顯著。

凋亡是細胞培養后期細胞死亡的主要方式，推測補料分批培養第10d細胞活率的差異可能是凋亡引起的。將補料分批培養第10d的細胞用于線粒體膜電位檢測，結果見圖4。

圖4 hMDHⅡ過表達提高線粒體膜電位Fig.4 Over－expression of hMDHⅡincreases mitochondrial membrane potential

從圖4可見，表達hMDHⅡ的細胞的綠色熒光強度與對照組相比提高了約10倍；對照組無明顯紅色熒光，而表達hMDHⅡ的細胞可見少量紅色熒光。表明大部分細胞線粒體處于低能量狀態，而且表達hMDHⅡ細胞的線粒體膜電位高于對照組，證實hMDHⅡ過表達提高了線粒體膜電位，抑制了細胞凋亡。

2.4 hMDHⅡ過表達降低活性氧

測定補料分批培養第10dCHO細胞內的活性氧，如圖5所示。圖中M1為熒光強度低的細胞，即活性氧水平低的細胞，M2為熒光強度高的細胞，即活性氧水平高的細胞。

從圖5可見，hMDHⅡ過表達后，M1數量明顯增加、M2數量大幅減少，總體熒光強度顯著降低，說明細胞內活性氧減少，其平均活性氧水平是對照組的1／10左右。可見，在CHO細胞內過表達hMDHⅡ能夠顯著減少細胞內的活性氧。

3 結論

圖5 hMDHⅡ過表達降低活性氧Fig.5 Over－expression of hMDHⅡ decreases ROS

成功構建了過表達人蘋果酸脫氫酶Ⅱ（hMDHⅡ）的重組CHO細胞，并考察了hMDHⅡ過表達對過氧化氫壓力下CHO細胞凋亡的影響。結果表明，hMDHⅡ過表達提高了過氧化氫壓力下的CHO細胞活率。進一步的檢測發現hMDHⅡ過表達可能通過減少活性氧的產生從而抑制細胞凋亡。

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