農桿菌介導的轉擬南芥AtCHX23基因玉米及其耐鹽性

岳潤清， 鐵雙貴， 韓小花， 齊建雙， 燕樹鋒， 林 鴻， 徐玉隔， 劉 芳

(1.河南省農業科學院糧食作物研究所，河南省玉米生物學重點實驗室，河南 鄭州 450002;2.鄭州大學生物工程系，河南鄭州 450001;3.河南師范大學生命科學學院，河南 新鄉 453007)

土壤鹽漬化是嚴重影響農業生產和生態環境的因素之一，全球約20%的耕地和將近一半的灌溉土地遭受鹽漬化影響［1］。中國現有鹽堿地9.913×108hm2，每年因鹽堿地造成的農業直接損失達數百億元［2］。玉米是中國第二大作物，可以用作糧食、飼料和工業原料等，是中國畜牧養殖業的支柱。然而，玉米對鹽分中度敏感，耐鹽性相對較差，這極大地限制了其種植面積的擴大。由于缺乏耐鹽玉米種質，嚴重限制了玉米耐鹽性的遺傳研究和耐鹽玉米新品種的選育。

基因工程的迅速發展與完善，為人類進一步提高作物的抗逆性提供了新的策略和強有力工具［3-4］。而利用基因工程遺傳轉化技術對作物進行改良，培育耐鹽性轉基因玉米新品種已經成為在鹽堿地上種植玉米的有效途徑之一［5］。國內外學者克隆了一些和耐鹽相關的基因，并進行遺傳轉化，獲得了一些耐鹽性較高的轉基因玉米新材料。Zhang等［6］和 Li等［7］將TsCBF1基因導入玉米自交系中，顯著提高了玉米抗旱或耐鹽能力。Chen等［8］將OsNHX1基因成功轉入玉米中，轉基因玉米耐鹽性得到提高。楊愛芳等［9］將來自大腸桿菌膽堿脫氫酶基因betA轉入玉米骨干自交系中，批量獲得了轉基因植株，從其后代中選育出耐鹽性大幅度提高的抗除草劑自交系。任小燕等［10］采用超聲波輔助花粉介導法將山菠菜膽堿單加氧酶AhCMO基因轉入玉米中，獲得耐鹽性提高的玉米新材料。王奕等［11］把耐鹽基因DREB2A轉入玉米自交系H99以及雜交種H99xA188，獲得轉基因陽性植株。這些研究結果表明采用基因工程技術培育玉米耐鹽品種是可行的。轉基因技術通過種屬間基因的流動彌補了玉米遺傳資源的不足，與常規育種結合必將帶來育種上的重大突破，它是農業生物技術的核心領域，并將成為作物育種的一種重要手段。

擬南芥CHX23基因是Song等［12］從擬南芥中克隆出的一個在植物抗鹽脅迫反應中起重要作用的基因，將其轉入煙草中后獲得了耐鹽轉基因煙草植株。本研究通過PCR方法試圖克隆擬南芥AtCHX23基因，構建植物組成型高效表達載體，并通過農桿菌介導法將其轉到玉米自交系鄭58中，對轉基因玉米耐鹽性進行初步研究，為培育轉基因耐鹽玉米提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥為哥倫比亞生態型，為河南省玉米生物學重點實驗室保存。玉米轉基因受體鄭58為河南省農業科學院糧食作物研究所提供，開花后12～14 d的玉米幼胚用于遺傳轉化。

各種限制性內切酶、T4連接酶、DNA聚合酶、反轉錄試劑盒等均購自 TaKaRa公司。農桿菌GV3101和DH5a由河南省玉米生物學重點實驗室保存;植物表達載體pGreen-0229為河南大學提供。DIG high primer DNA labeling and detection starter kit I為Roche產品;其他藥品、試劑均為分析純，購自上海生工生物工程有限公司。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1AtCHX23基因的克隆與植物表達載體的構建 從擬南芥基因組中克隆AtCHX23基因(上游引物:5'-ATACTCGAGATGTCTTCCGGAGCCCCC-3';下游引物:5'-TGTAAGCTTTTACCTATGAATTCCATATTGATGAT-3')，構建到植物表達載 pGreen-0229載體上，16℃ 過夜連接，將構建的重組質粒pGreen-0229-AtCHX23轉化到大腸桿菌DH5α，對獲得的重組質粒進行酶切，PCR鑒定。其中35S組成型高表達啟動子控制AtCHX23基因的表達，Bar基因標記基因為篩選標記。

1.2.2 玉米的遺傳轉化及抗性植株的分子鑒定玉米幼胚的遺傳轉化參照劉允軍［13］的方法，通過凍融法將表達載體導入農桿菌GV3101。在篩選培養基上添加雙丙胺膦篩選抗性苗，將獲得的抗性苗進行煉苗移栽。植物DNA提取按照改良后Saghai-Maroof等［14］提出的CTAB方法進行，以轉基因和野生型植株玉米葉片的全基因組DNA為模板，根據AtCHX23序列特異引物(上游引物:5'-CTACTATCTAACCCGACCCTTG-3';下游引物:5'-AAAGAAGCAAACCCAAAAAC-3')檢測轉基因株系。將通過PCR篩選出的其中2個陽性轉基因株系進行Southern blot試驗鑒定。玉米基因組DNA經BamH I酶切后，電泳轉膜，利用標記試劑盒(Primer-a-gene Labeling System Promega，USA)和 α-32P-dCTP(上海生工生物工程有限公司)進行標記［15］，整個試驗過程在浙江大學植物生理與生化重點實驗室完成。

轉基因植株的RNA提取以及RT-PCR檢測:取0.1 g新鮮玉米葉片，液氮充分研磨后，用Trizol(Invitrogen，USA)提取葉片總RNA，以Oligo(dT)為引物(北京天根生化科技有限公司)，利用反轉錄試劑盒(Invitrogen，USA)進行cDNA的合成后，按照上述基因組DNA的PCR檢測方法進行擴增。

1.2.3 鹽脅迫處理及玉米幼苗生理指標的測定 選取健康、大小、飽滿度一致的鄭58非轉基因玉米種子，用10 g/L次氯酸鈉溶液消毒20 min，清水洗凈后于室溫下清水浸種6 h，然后將其置于鋪有兩層濾紙的培養皿中，于培養箱中發芽，其間及時補充清水保持濕度。3 d后，挑選芽期生長狀況良、長勢一致、且PCR檢測陽的幼苗，轉移至150 mmol/L NaCl的Hoagland營養液中進行鹽脅迫處理［10］，每天按此濃度澆灌。7 d后，取玉米葉片進行檢測。葉片可溶性糖(WSS)含量的測定采用蒽酮法;游離脯氨酸(Pro)含量的測定采用磺基水楊酸法;丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法［16］。每個分析樣本取10株進行測定，重復3次，取其平均值。

2 結果

2.1 AtCHX23基因的克隆和載體構建

根據AtCHX23基因DNA序列設計引物，采用PCR方法從擬南芥基因組擴增2.6 kp DNA片段，連接到T載體，經測序和Blast驗證，擴增片段確實為AtCHX23基因序列，采用XhoI和XbaI分別對TAtCHX23和 pGreen0229載體進行雙酶切，過夜連接。得到植物表達載體pGreen0229-35S-AtCHX23。測序結果顯示，AtCHX23基因正確插入CaMV35S啟動子和終止子之間。

2.2 轉AtCHX23基因玉米植株的獲得

取授粉后10～14 d的玉米穗進行剝胚，以大小為1.0～2.0 mm的幼胚作為外植體，通過農桿菌介導法將AtCHX23基因導入優良自交系鄭58中，經過雙丙胺膦(Bar基因3.0 mg/L)的篩選、愈傷組織分化、再生苗的生根和壯苗培養(圖1)，共獲得56株具有雙丙胺膦抗性的T0代玉米再生植株。

圖1 玉米轉基因植株的再生Fig.1 Regeneration of transgenic maize plants

為了檢測再生玉米基因組中是否有AtCHX23基因的插入，以AtCHX23基因特異引物進行PCR擴增檢測，陽性植株擴增出與質粒相同大小的片段，而受體對照植株未擴增出相應片段，可以初步證明外源基因已經整合到玉米基因組中(圖2)。從圖2我們可以也看出PCR共檢測得到26株陽性植株，抗性植株陽性率為44.8%。3次重復結果一致。26株陽性植株是從6個不同的抗性愈傷組織塊得到的，因此我們可以初步認為有6個獨立的T0代陽性轉基因株系，選取其中2個長勢比較好株系，命名為Ov1和Ov3，用于下一步分子檢測和抗性鑒定試驗。

圖2 T0代轉基因抗性植株的PCR檢測Fig.2 PCR analysis of T0 transgenic maize plants

2.3 轉基因玉米植株的分子檢測

為了進一步確定外源基因的整合情況，對PCR陽性株系Ov1和Ov3植株進行Southern blot分析，提取葉片基因組DNA用BamH I酶切后，以Bar基因片段為探針進行雜交，雜交結果顯示，這2個PCR陽性株系可以檢測到雜交條帶(圖3A)，仍表現為陽性，并且每個株系雜交條帶只有一條，位置不同，而野生型(WT)中沒有檢測到雜交信號，表明Ov1和Ov3為2個獨立的陽性轉基因株系，在這2個株系中AtCHX23基因以單拷貝形式成功整合到玉米基因組。

提取Ov1和Ov3株系葉片的總RNA，利用RTPCR方法分析轉基因株系中外源基因AtCHX23的轉錄情況。結果顯示，以這2個轉化植株的cDNA為模版，以AtCHX23基因的特異引物進行PCR擴增均有陽性條帶出現，并且這2個轉基因玉米株系中AtCHX23基因的表達水平比較高，而對照株系沒有擴增出相應條帶，表明在這2個陽性株系中外源基因AtCHX23過量表達(圖3B)。

圖3 2個玉米轉基因株系的Southern blot(A)和RT-PCR(B)分析Fig.3 Analysis of two transgenicmaize lines by Southern blot(A)and RT-PCR(B)

2.4 轉基因玉米的耐鹽性分析

取轉AtCHX23基因的Ov1和Ov3 2個株系的T3代植株進行耐鹽性分析，首先對其芽苗進行PCR檢測，轉基因苗全部為陽性，說明T3代轉基因株系已經純合，部分PCR檢測結果如圖4A。鹽脅迫處理3 d后，轉基因玉米株系和對照株系的生長差異較小;但隨著鹽脅迫處理時間的增長，處理7 d后，Ov1和Ov3這2個轉基因玉米株系已明顯優于野生型玉米(圖4B)。野生型植株大部分葉子卷曲、葉尖變黃，嚴重的植株全部變黃卷曲死亡;鹽脅迫下，轉基因植株也受到一定影響，部分葉尖出現卷曲變黃，但2個轉基因株系Ov1和Ov3長勢優于野生型。另外，在無鹽脅迫的狀態下，轉AtCHX23基因的2個株系Ov1、Ov3和野生型植株之間沒有明顯的生長差異(圖4C)。由此可見，AtCHX23基因的轉入能夠提高玉米苗期的耐鹽性。

2.5 鹽脅迫下轉基因玉米生理生化指標的變化

為了驗證AtCHX23基因的過量表達是否影響玉米中可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量，對處理10 d野生型和2個轉基因株系(Ov1和Ov3)地上部可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量進行檢測。非鹽脅迫條件下，野生型和2個轉基因株系中可溶性糖、脯氨酸和丙二醛的含量基本無顯著差異，但在150 mmol/L NaCl處理下，轉基因玉米株系和野生型的可溶性糖和脯氨酸含量都有增長趨勢，其中2個轉基因株系中可溶性糖含量分別達到46.9μg/g和44.5μg/g，分別是野生型的1.26和1.28倍，提高了27.9%和26.1%;2個轉基因株系中脯氨酸含量與野生型相比，分別提高了33.5%和34.6%(圖5);但2個轉基因株系中丙二醛含量低于野生型，野生型株系丙二醛含量為12.66μmol/g，Ov1和Ov3 2個轉基因株系丙二醛含量分別為7.90μmol/g和8.38 μmol/g，2個轉基因株系中丙二醛含量比野生型分別減少了37.6%和33.8%(圖5)。

3 討論

圖4 轉基因玉米和野生型幼苗在NaCl處理7 d后的植株表現特征Fig.4 Phenotypes of transgenic and wild-typemaize seed lings under NaCl treatment for seven days

圖5 野生型和轉基因株系在0和150 mmol/L NaCl處理下可溶性糖、脯氨酸和丙二醛的含量Fig.5 Soluble sugar，protein and methane dicarboxylic aldehyde contents of maize seedlings of wild type and two transgenic lines under 0 and 150 mmol/L NaCl treatments

近年來，用于轉基因玉米遺傳轉化方法很多:有超聲波處理花粉介導法［10］、基因槍法［17-18］和農桿菌介導方法［19-21］等。農桿菌作為一種天然的植物基因轉化系統，具有能轉移較大的DNA片段、整合的外源基因重排少且多以單或寡拷貝整合并能穩定遺傳等優點，在玉米遺傳轉化中應用最多。孫傳波等［22-23］通過農桿菌介導法將耐鹽基因HAL1轉入到玉米自交系H99中，獲得再生植株。Zhang等［6］采用農桿菌介導法將TsCBF1基因導入玉米中，并且在其后代中表達。Assem［24］將NPK1基因與Bar基因結合后用農桿菌介導法轉化到玉米自交系中。Wang［25］利用農桿菌介導法在轉基因玉米中進行ZmPLC1基因正、反方向表達，并由Southern雜交證實ZmPLC1基因已整合到玉米基因組中。這些研究說明應用農桿菌介導方法轉化外源DNA可以得到玉米抗旱新資源，是一種可行、有效的抗旱育種方法。我們通過河南省玉米生物學重點實驗室建立并優化的農桿菌介導的方法將擬南芥AtCHX23基因導入鄭單958的優良親本自交系材料鄭58中，經過共培養、恢復培養和3次除草劑篩選后，共獲得轉化植株56株，通過PCR初步鑒定，其中26株呈陽性，抗性植株陽性率為44.8%;通過對轉基因株系進行分子鑒定、轉錄表達分析及 Southern blot鑒定，獲得了以單拷貝的形式成功插入到玉米基因組中且AtCHX23基因過量表達的2個玉米株系，證明外源基因AtCHX23已經整合到鄭單958的優良親本自交系材料鄭58中。這些研究結果表明利用基因工程向栽培植物導入外源目的基因，已發展成為改良玉米耐鹽性的新途徑。

關于AtCHX23耐鹽性研究，在擬南芥和煙草方面已經得到證明，超表達AtCHX23的擬南芥和煙草植物，抗鹽性均比對照提高20%［12］。本試驗結果表明過量表達AtCHX23基因能提高轉基因玉米的耐鹽性。前人研究結果表明當NaCl濃度為150 mmol/L時，鄭58幼苗植株能表現出受害癥狀［10］。因此本試驗選擇150 mmol/L作為玉米苗期耐鹽處理濃度。在本研究中，正常情況下，轉基因株系和野生型間生長無明顯差異，但在鹽脅迫下，玉米幼苗受到一定的影響，包括轉基因植株，部分葉尖出現卷曲變黃，但與野生型相比，轉基因株系生長優勢明顯。由此可見，AtCHX23基因的轉入能夠提高轉基因玉米的耐鹽性。

研究結果表明:玉米幼苗在鹽脅迫下，無論生長發育狀況和生理生化指標都受到很大影響［26］。本試驗在正常情況下，非轉基因和轉基因株系中可溶性糖、脯氨酸和丙二醛的含量無顯著差異;鹽脅迫下，2個轉基因玉米株系的可溶性糖、脯氨酸含量高于非轉基因玉米，轉耐鹽基因玉米株系Ov1和Ov3的可溶性糖含量為野生型的1.26和1.28倍，而相應地2個轉基因株系脯氨酸含量為野生型的1.33倍和1.35倍;轉基因玉米株系可溶性糖、脯氨酸含量的提高可能因為AtCHX23基因的過量表達可以起到穩定細胞膜和原生質作用所致［27］，是轉基因玉米適應鹽脅迫下的一種生理調控防御反應機制，這與Lutts等［28］的研究結果是相對應的;與可溶性糖、脯氨酸含量變化不同的是:轉基因玉米株系Ov1和Ov3地上部丙二醛含量均低于非轉基因對照，其原因可能是由于AtCHX23基因的大量表達降低了轉基因植物在鹽脅迫下膜脂的抗氧化能力，提高了植物組織的保護能力。本試驗證明過量表達AtCHX23基因能提高轉基因玉米苗期的耐鹽性，而關于AtCHX23基因在玉米鹽脅迫中的表達調控功能有待進一步研究。

［1］ MUNNS R，TESTER M.Mechanisms of salinity tolerance［J］.Annual Review of Plant Biology，2008，59:651-681.

［2］ ZHANG J F，FANG Y F，MAKESCHIN F，et al.Agroforestry and its application in amelioration of saline soils in Eastern China Coastal Region［J］.Forestry Studies in China，2004，6(2):27-33.

［3］ 黃 銅，莫正海，李 卉，等.延長觀賞植物花期的技術措施［J］.江蘇農業科學，2012，40(10):168-170.

［4］ 洪學欽，金 剛，代建國，等.塔胞藻基因工程的抗生素篩選標記［J］.江蘇農業科學，2012，40(8):49-51.

［5］ YAMAGUCHIT，BLNM W E.Developing salt-tolerant crop plants:challenges and opportunities［J］.Trends Plant Sci，2005，10(12):615-620.

［6］ ZHANG S J，LIN，GAO F，et al.Over-expression ofTsCBF1gene confers improved drought tolerance in transgenic maize［J］.Molecular Breeding，2010，26(3):455-465.

［7］ LIB，LIN，DUAN X G，et al.Generation of marker-free transgenicmaize with improved salt tolerance using the FLP/FRT recombination system［J］.Journal of Biotechnology，2010，145:206-213.

［8］ CHEN M，CHEN Q J，NIU X G，et al.Expression ofOsNHX1gene in maize confers salt tolerance and promotes plant growth in the field［J］.P1ant Soil Environ，2007，53(11):490-498.

［9］ 楊愛芳，張可煒，尹小燕，等.轉基因耐鹽玉米自交系的農藝性狀及雜種優勢表現 的分析［J］.中國農業科學，2007，40(12):2895-2902.

［10］ 任小燕，杜建中，孫 毅.轉AhCMO基因玉米后代的獲得及耐鹽性鑒定［J］.分子植物育種，2013，11(3):332-338.

［11］ 王 奕，任 賢，于志晶，等.農桿菌介導法將DREB2A基因轉入玉米［J］.分子植物育種，2013，11(1):48-52.

［12］ SONG C P，GUO Y，QIU Q S，et al.A probable Na+/K+/H+exchanger on the chloroplast envelope functions in pH homeostasis and chloroplast development inArabidopsis thaliana［J］.PNAS，2004，101(27):10211-10216.

［13］ 劉允軍.人工改造的cry1Ac、cry1Ie基因在大腸桿菌、轉基因煙草和玉米中的表達［M］.北京:中國農業大學，2004.

［14］ SAGHAI-MAROOFM A，SOLIMAN K M，JORGENSEN R A，et al.Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in Barley:Mendelian inheritance，chromosomal location and population dynamics［J］.Proceedings of the National Academy of Science，1984，81(24):8014-8018.

［15］ YUE RQ，WANG X F，CHEN JY，et al.A rice stromal processing peptidase regulates chloroplast and root development［J］.Plant Cell Physiol，2010，51(3):475-485.

［16］ 楊 升，張華新，張 麗.植物耐鹽生理生化指標及耐鹽植物篩選綜述［J］.西北林學院學報，2010，25(3):59-65.

［17］ GORDON-KAMM W J，SPENCER TM，MANGANO M L，et al.Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants［J］.Plant Cell，1990，2(7):603-618.

［18］ WAN Y，WIDHOLM JM，LEMAUX P G.Type I callus as a bombardment target for generating fertile transgenic maize(Zea maysL.)［J］.Planta，1995，196(1):7-14.

［19］ ISHIDA Y，SAITO H，OHTA S，et al.High eficiency transforma-tion of maize(Zea maysL.)mediated byAgrobacterium tumefaciens［J］.Nat Biotechno1，1996，14(6):745-750.

［20］ ZHAO Z Y，GUW，CAIT，et al.High throughputgenetic transformation mediated byAgrobacterium tumefaciensin maize［J］.Mol Breeding，2001，8(4):323-333.

［21］ FRAME B R，SHOU H，CHIKWAMBA R K，et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system［J］.Plant Physio1，2002，129(1):13-22.

［22］ 孫傳波，曲文利，姜志磊，等.農桿菌介導向玉米莖尖導入HAL1基因的初步研究［J］.玉米科學，2009，17(6):32-34.

［23］ 孫傳波，郭 嘉，陶 蕊，等.農桿菌介導法將耐鹽基因HAL1轉入玉米自交系H99的研究［J］.分子植物育種，2011(9):1162-1166.

［24］ ASSEM SK.Genetic transformation of the nicotiana protein kinase(NPK1)gene confers osmotic tolerance in Egyptian maize［J］.Australian Journal of Basic and Applied Sciences，2009，3(2):828-835.

［25］ WANG CR.Enhaneed expression of phospholipase C1(ZmPCL)improves drought tolerance in transgenicmaize［J］.Planta，2007，227(5):1127-1140.

［26］ 王麗燕，趙可夫.玉米幼苗對鹽脅迫的生理響應［J］.作物學報，2005，31(2):264-266.

［27］ 盧靜君，李 強，多立安.鹽脅迫對金牌美達麗和獵狗種子萌發的影響［J］.植物研究，2002，22(3):328-332.

［28］ LUTTSS，KINET JM，BOUHARMONT J.Effects of salt stress on growth，mineral nutrition and proline accumulation in relation to osmotic adjustment in rice(Oryza sativeL.)cultivars deffering in salinity resistance［J］.Plant Growth Regul，1996(19):207-218.