一管式多引物焦磷酸測序技術(shù)在HPV分型檢測中的應(yīng)用

鐘 丹，薛 群，王淑一（杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心，杭州 310023）

人類乳頭瘤病毒（HPV）是一群微小的、無包膜的雙鏈DNA病毒，其DNA長約8kb。目前發(fā)現(xiàn)的HPV基因型已經(jīng)超過了100種［1］。根據(jù)不同基因型HPV致瘤能力的高低，一般將其分為高危型、潛在高危型和低危型3類［2－3］。基礎(chǔ)研究和流行病學(xué)調(diào)查研究證據(jù)都表明，HPV特別是高危型HPV的感染是幾乎導(dǎo)致子宮頸癌的必要條件［4］。本研究采用焦磷酸測序技術(shù)，在1個標(biāo)本模板孔中使用多個測序引物，同時對7種 HPV亞型，即 HPV－6、11、16、18、31、33、45基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測，以期為一管式多引物焦磷酸測序技術(shù)在HPV分型檢測中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 志愿參加本次研究的女性患者517例，均簽署知情同意書，年齡19～51歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集和預(yù)處理 用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細(xì)胞；在進(jìn)行涂片標(biāo)本細(xì)胞學(xué)檢查的同時，將標(biāo)本放入5mL含有0.05%硫柳汞的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，離心（3 000×g、10min）洗滌2次，沉積細(xì)胞重懸于1mL PBS中，取0.5mL細(xì)胞懸液抽提DNA。

1.2.2 標(biāo)本核酸的提取 按1體積細(xì)胞懸液加入10倍體積的細(xì)胞裂解液［10mmol／L鹽酸三羥甲基氨基甲烷（Tris－HCl），pH7.4，10mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA），150mmol／L氯化鈉（NaCl），0.4%十二烷基磺酸鈉（SDS），1.0mg／mL蛋白酶K］，37℃溫育過夜；以等體積酚／氯仿（1∶1），氯仿／異戊醇（24∶1）各抽提2次；加入1／10倍體積的3mol／L、pH5.2乙酸鈉（NaAc）及2.5倍體積無水乙醇，－20℃放置2h或過夜以沉淀DNA；加入1倍體積乙醇洗滌1次；用60μL含RNA酶（100μg／mL）的 TE 溶 液 （10mmol／L Tris－HCl，pH 8.0，1.0mmol／L EDTA）溶解 DNA，37℃溫育30min。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增 （1）半巢式 PCR 擴(kuò)增HPV通用型引物：MY09引物序列為5′－CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC－3′，MY11 引 物 序 列 為 5′－GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG－3′，其中，M 為 A 或 C、R為 A 或G、W 為 A或T、Y為C或 T；GP6＋引物序列為5′－biotin－GAA AAA ATA AAC TGT AAA TCA TAT TC－3′。（2）PCR 擴(kuò)增：反應(yīng)體系為20μL，包括1×PCR緩沖液、0.4mmol／L dNTP、0.2μmol／L引物、KODFX PCR擴(kuò)增酶0.02U／μL、模板2μL；反應(yīng)條件為95℃3min、95℃10s、54℃30s、72℃30s循環(huán)10次，95℃10s、40℃30s、72℃30s循環(huán)30次，72℃5min。（3）對照設(shè)置：每次試驗均設(shè)陽性及陰性對照，以載有6型HPV基因組序列的重組質(zhì)粒（每個反應(yīng)為100pg）為陽性對照，以無HPV基因組序列的人細(xì)胞DNA為陰性對照。（4）凝膠電泳：對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外線下觀察和拍照。

1.2.4 焦磷酸測序 （1）應(yīng)用 QIAGEN PyroMark Q96ID型焦磷酸測序儀配套的單鏈純化裝置從PCR反應(yīng)體系中分離出單鏈DNA；（2）在QIAGEN PyroMark Q96ID型焦磷酸測序儀測序板的每個反應(yīng)孔中分裝45μL測序反應(yīng)液，將分離好的單鏈DNA轉(zhuǎn)入測序板孔，測序板80℃溫浴2min后轉(zhuǎn)至室溫冷卻；（3）將測序板放入測序儀中，新建1個SQA程序，根據(jù)測序儀程序自動計算出的試劑量在試劑倉中加入相應(yīng)體積的試劑，包括酶類、底物熒光素、dATP、dCTP、dGTP、dTTP，運行程序。

1.2.5 PCR－反向點雜交法 采用PCR體外擴(kuò)增和DNA反向點雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)。利用HPV的基因特點設(shè)計特異引物，對23種HPV基因型的目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在膜條上的包括18種高危型和5種低危型在內(nèi)的分型探針進(jìn)行雜交，依據(jù)雜交信號的有無來判斷HPV感染情況并加以分型。

1.2.6 結(jié)果讀取及分析 根據(jù)GenBank網(wǎng)站上針對不同HPV型別所設(shè)計的引物繼而進(jìn)行測序所得到的序列（表1），通過焦磷酸測序結(jié)果圖讀取HPV基因擴(kuò)增陽性標(biāo)本中的HPV型別。

表1 焦磷酸測序HPV分型結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 半巢式PCR擴(kuò)增片段的電泳鑒定 517例標(biāo)本中有218例可成功擴(kuò)增出明顯的190bp的目的條帶，部分標(biāo)本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 半巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2 焦磷酸HPV分型結(jié)果 將擴(kuò)增出目的條帶的半巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序分析，采用多引物測序法，根據(jù)表1焦磷酸測序讀取序列，通過分析焦磷酸測序結(jié)果圖讀取HPV型別。采用多引物測序法測序得到的焦磷酸測序結(jié)果圖見圖2。根據(jù)HPV分型讀取序列比對，可對標(biāo)本中的HPV進(jìn)行分型。218例PCR擴(kuò)增陽性標(biāo)本中，可判斷為HPV－6、11、16、18、31、33、45的標(biāo)本有 62例，其中 HPV－6占 12.9%，HPV－11占11.29%，HPV－16占37.1%，HPV－18占12.9%，HPV－31占6.45%，HPV－33占9.68%，HPV－45占 6.45%。不同型別HPV多重感染標(biāo)本焦磷酸測序結(jié)果圖見圖3。共檢出HPV－16、18多重感染標(biāo)本及HPV－18、45多重感染各1例，檢出率均為1.6%。

圖2 多引物測序法焦磷酸測序圖

2.3 焦磷酸HPV分型與PCR－反向點雜交法檢測一致性分析 本研究中7種HPV型別測序陽性標(biāo)本再次通過PCR－反向點雜交法檢測，結(jié)果兩種方法7中HPV型別的判斷結(jié)果均相符，兩種方法檢測結(jié)果具有良好的一致性。

3 討 論

基因測序是分子診斷領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。傳統(tǒng)的基因測序方法是Sanger終止法，該方法一次只能讀取單個基因的序列，因此，對于有眾多基因亞型的病原體感染性疾病，很難獲得理想的測序結(jié)果［5］。焦磷酸測序技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的序列分析技術(shù)，其分析原理是：核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶的級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光，通過檢測發(fā)光信號而獲得測序結(jié)果。焦磷酸測序技術(shù)最大優(yōu)點是可以實現(xiàn)高通量、高效率，最為重要的是，可同時檢測多至5種以上病原體基因亞型，對于當(dāng)前日益增多的混合型HPV感染無疑具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［6］。

本研究采用一管式多引物測序法，根據(jù)臨床相關(guān)性和流行性，設(shè)計了7個測序引物在同一反應(yīng)孔中進(jìn)行測序，可同時檢測的病原體包括高危型 HPV－16、18、31、33，以及與腫瘤形成相關(guān)的HPV－45。據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)80%的宮頸癌患者都存在上述 HPV亞型單獨或混合感染［2，7］。此外，低危型 HPV－6和HPV－11則在生殖器疣的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。本研究結(jié)果證明，與采用通用引物進(jìn)行測序的傳統(tǒng)方法相比，一管式多引物測序法在引物設(shè)計方面有助于更有效地針對不同亞型的特異性區(qū)域，所采用的焦磷酸測序技術(shù)則能夠準(zhǔn)確、快速地分型，從而降低成本，縮短檢測時間。而且，另有研究發(fā)現(xiàn)該方法不僅能夠檢測混合型感染標(biāo)本，還能確定不同型別病原體所占的比例［8］。

雜交法的臨床應(yīng)用已得到普及，但臨床實踐中存在一定的假陰性和假陽性結(jié)果，且不能排除發(fā)生交叉污染的可能性［9］。本研究采用焦磷酸測序技術(shù)檢出218例HPV感染標(biāo)本，并對病原體進(jìn)行了分型，與雜交法檢測結(jié)果比較，二者檢測結(jié)果的符合率是100%。焦磷酸測序法一次性檢測標(biāo)本數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他方法，并能夠同時檢測混合型感染，操作方便，并且能夠較為直觀、準(zhǔn)確地讀取測序結(jié)果。已證實HPV感染是腫瘤、宮頸上皮內(nèi)瘤變和疣的主要致病因素，HPV檢測在上述疾病常規(guī)初篩中的應(yīng)用價值較高，已在臨床中廣泛應(yīng)用，而且，由于不同的HPV型別具有不同的致病性，所以研究HPV檢測方法十分重要［2］。本研究對PCR擴(kuò)增后的片段進(jìn)行多引物測序序列分析，不僅可以檢測具體型別，還可以對混合型感染中的HPV型別進(jìn)行鑒別，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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