高滲應激環境下傷寒沙門菌t4606基因功能研究＊

繆敏慧，孟紅委，倪紅元，戴如順，王 敏，杜 鴻（蘇州大學附屬第二醫院檢驗科，江蘇蘇州 215004）

傷寒沙門菌是沙門菌屬中經消化道感染人類的致病菌之一，可導致感染患者發生全身系統性感染，并能引發腸穿孔等嚴重的并發癥，進而危及感染患者的生命［1－2］。傷寒沙門菌作為食源性致病菌，必須克服人體腸道內的高滲應激環境才能最終致病。筆者在前期的研究工作中發現，在高滲應激環境下，傷寒沙門菌t4606基因的表達受到兩個重要的sigma因子，即RpoE和RpoS的雙重調控［3］，提示t4606基因對傷寒沙門菌克服高滲應激環境極為重要。本研究利用原核生物基因敲除技術制備了傷寒沙門菌t4606基因缺陷株，并分析了其在高滲應激環境下的生物學特性，旨在通過分析t4606基因的功能，及其在沙門菌致病機制中的作用，為臨床治療和預防傷寒沙門菌感染提供可能的靶向基因。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒 本試驗所采用的傷寒沙門菌、自殺質粒及大腸埃希菌（E.coli）DH5α菌株由本實驗室保存。

1.2 試劑 核酸限制性內切酶BglⅡ、BamHⅠ及用于聚合酶鏈反應（PCR）的EXTaq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；質粒提取試劑、膠回收試劑及T4DNA連接酶購自美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 t4606基因缺陷株的制備 利用原核生物基因同源重組技術制備t4606缺陷變異株，篩選連續3次傳代均獲得穩定重組的菌株作為t4606基因缺陷變異株，并采用序列分析進行驗證。具體方法參考文獻［4］。相關引物見表1。

1.3.2 t4606基因缺陷株回補株的制備 設計特異性引物擴增t4606基因全長，上、下游引物的5′端分別加入NcoⅠ、SalⅠ酶切位點（見表1），擴增獲得的全長片段經酶切后與表達載體pBAD／gⅢ（阿拉伯糖操縱元）連接，克隆至E.coli DH5α感受態細胞，利用質粒的氨芐西林抗性初步篩選陽性重組質粒，篩選獲得的陽性重組質粒采用PCR及序列分析進行驗證（由上海生工生物技術公司完成）。培養經驗證確定的陽性重組菌株，提取重組質粒pBADt4606，電擊導入t4606變異株，經酶切及PCR驗證后命名為回補菌Δt4606（pBADt4606）。采用質量體積比（W／V）為0.2%的阿拉伯糖誘導質粒表達，具體方法參考文獻［5］。

表1 PCR引物及序列

1.3.3 生長曲線分析 基因缺陷株、缺陷回補株和野生株分別在37℃條件下，于LB培養液中振搖培養過夜；過夜培養后以1∶100的比例轉入新鮮、預熱的LB培養液，每隔1h檢測培養液在600nm處的吸光度值（A600值），以A600值為縱坐標，培養時間為橫坐標繪制生長曲線。用相同方法比較t4606缺陷株和野生株在高滲應激（300mmol／L NaCl）環境下的生存能力。每組實驗重復3次。于對數生長早期（培養4h）和對數生長晚期（12h）比較不同菌株培養液的A600值。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行數據處理和統計學分析。計量資料組間比較采用t檢驗；P＜0.05為比較差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 成功制備t4606基因缺陷株 首先利用自殺質粒所具有的氨芐西林抗性，在含有氨芐西林的LB平板上篩選具有抗性的菌落，再進一步篩選耐蔗糖的菌落。以篩選獲得的陽性菌落DNA為模板，用t4606基因上、下游引物P1A和P2B進行PCR擴增，分析傷寒沙門菌t4606基因的重組變異情況。PCR擴增檢測相應菌落，直至篩選獲得連續傳代超過3次均僅有缺損片段的菌株。所獲得的菌株即為穩定的t4606基因缺陷株。缺陷株及野生株PCR產物電泳結果見圖1。經DNA序列分析，進一步證實702bp處被BglⅡ核酸限制性內切酶的6個堿基酶切位點所替代。

圖1 t4606缺陷株及野生株PCR產物電泳圖

2.2 成功構建回補菌株Δt4606（pBADt4606） 為進一步證實t4606基因的功能，利用表達載體pBAD／gⅢ將t4606基因回補引入t4606基因缺陷株，構建回補菌株Δt4606（pBADt4606）。利用質粒的氨芐西林抗性，初步篩選攜帶回補t4606基因質粒的細菌后，提取質粒，進行酶切及PCR驗證，酶切產物電泳結果見圖2。DNA序列分析證實堿基序列與實驗設計一致。

圖2 回補t4606基因的鑒定

2.3 生長曲線分析 于對數生長早期（培養4h）和對數生長晚期（12h）檢測并比較不同菌株培養液的A600值，結果顯示，高滲應激環境下t4606缺陷株（Δt4606）的生存能力明顯弱于野生株（4h：t＝22.725，P＜0.05；12h：t＝5.008，P＜0.05），回補t4606基因至t4606缺陷株后，細菌生存能力恢復至野生株水平（4h：t＝3.559，P＞0.05；12h：t＝0.404，P＞0.05），說明t4606基因在細菌適應高滲應激環境時發揮了重要作用。生長曲線如圖3所示。

圖3 不同菌株在高滲應激環境下的生存曲線

3 討 論

傷寒沙門菌作為食源性致病菌，常通過污染食物而經消化道入人體內，進而造成全身性感染，嚴重時可危及感染患者的生命。全球每年約有2 100 萬人感染傷寒沙門菌，其中死亡人數超過21萬，即使在發達國家，傷寒沙門菌的暴發流行也時有發生［6］。傷寒沙門菌在致病過程中，必須克服人體腸道內的高滲應激環境才能最終致病［7－8］。在應激環境下，細菌需要及時有效地調節某些基因的表達和蛋白的活性，從而適應新的環境。盡管傷寒沙門菌已成為重要的原核生物研究模式菌，其全基因組結構也已闡明，然而仍然有近三分之一基因的功能尚不明確，而這些基因在細菌生存過程中可能具有極為重要的生物學作用。隨著一些未知基因功能的逐步明確，對傷寒沙門菌致病機制的認識也將進一步深入。然而，如何選擇在傷寒沙門菌適應應激環境時發揮重要作用的未知功能基因，是后續研究工作中的難點。

筆者前期利用傷寒沙門菌全基因組芯片，研究了高滲應激環境下的兩個重要調節因子（RpoE和RpoS）的雙重調控作用，結果發現，在傷寒沙門菌處于高滲應激環境時，t4606基因的表達同時受到RpoE和RpoS的雙重調控，說明t4606基因在傷寒沙門菌適應高滲應激環境方面具有重要的意義［3］。進一步利用生物信息學軟件對t4606基因序列進行分析后發現，t4606基因具有70%的Patatin樣磷脂酶基序，可能編碼一種Patatin樣磷脂酶。Patatin樣磷脂酶和細菌的侵襲性和毒力密切相關。Banerji和Flieger［9］的研究表明，具有致病性的細菌內，含有Patatin樣編碼區域的蛋白比非致病性細菌更為常見。也有研究表明，銅綠假單胞菌肺炎患者體內出現急性肺損傷，有可能是由銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統分泌的ExoU毒素進入真核細胞的細胞質所致［10］。ExoU毒素由exoU基因編碼，而exoU基因類似于傷寒沙門菌t4606基因，其所編碼蛋白質的氨基酸序列中具有Patatin樣磷脂酶片段，且該片段與哺乳動物體內的非鈣離子依賴性磷脂酶A2具有同源性，并且ExoU毒素的溶血磷酸酶A活性和細胞毒作用與該片段有關［10］。傷寒沙門菌中是否存在Patatin樣磷脂酶尚無文獻報道，值得進一步深入研究。

本研究采用分子生物學技術，結合t4606基因的特性，通過優化相關實驗條件，成功制備了傷寒沙門菌t4606基因缺陷株及其回補株，并觀察了不同菌株在模擬人體腸道高滲應激環境下的生存能力。通常情況下，腸道致病菌在進入人體腸道后，必須適應環境滲透壓的巨大改變，即從食物中的低滲環境到腸道內的高滲環境。致病菌只有適應了新的滲透壓環境，才能侵襲腸上皮細胞。因此，了解傷寒沙門菌適應人體腸道內高滲應激環境的機制，對進一步分析傷寒沙門菌的整體致病機制具有重要的意義。本研究中的生長曲線分析證實，高滲應激環境下，t4606缺陷株的生長能力明顯弱于野生株，但在回補t4606基因至t4606缺陷株后，其生長能力恢復至野生株水平。由此可見，t4606基因在傷寒沙門菌適應高滲應激環境方面發揮著重要的作用。

本文對高滲應激環境下傷寒沙門菌t4606基因的生物學功能進行了初步研究，為進一步深入了解t4606基因在傷寒沙門菌中發揮作用的機制奠定了基礎，也說明t4606有可能作為臨床預防和治療傷寒沙門菌感染的靶向基因，為傷寒沙門菌感染的臨床分子靶向治療提供了新的研究方向。

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