氯氰菊酯和吡蟲啉對克氏原螯蝦AchE和Na+—K+—ATPase活性的影響

摘 要：乙酰膽堿酯酶（AChE）是一種廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物體內，在神經傳導中起著重要的作用的水解酶。研究發現，暴露于亞致死濃度的殺蟲劑AChE會被嚴重抑制，因此這種酶常用來作為評價環境污染的生物標志物；Na+-K+-ATPase則幾乎存在于所有動物的細胞膜上，是橫跨質膜的一種重要酶類，其維護的離子梯度具有重要的生理意義。水體中污染物如農藥、工業品多氯聯笨等物質對許多水生無脊椎動物Na+-K+-ATPase有著不同程度的抑制作用。為此，本試驗研究了克氏原螯蝦暴露于亞致死濃度氯氰菊酯和吡蟲啉后AChE和Na+-K+-ATPase的活性變化，為選用生物標志物或早期預警系統監測環境中的有關農藥以及評估這兩種農藥對養殖優勢種克氏原螯蝦的危害性提供依據。

關鍵詞：氯氰菊酯；吡蟲啉；克氏原螯蝦

1 材料和方法

1.1 試驗用蝦

實驗用蝦采于鄱陽湖南磯山水域，體長8±0.474cm，體重13±2.669g，試驗前在水箱中暫養7-10天，所用水為充分曝氣的自來水，試驗時選擇無病傷，個體健壯，活力強的蝦。

1.2 試劑及儀器

722分光光度計，電子分析天平，玻璃勻漿器，恒溫水浴鍋，TGL-16A臺式高速冷凍離心機，烘箱，冰箱等。試劑盒均采購于南京建成生物研究所，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.3 馴養

實驗用蝦在實驗前馴養于塑料水族箱中，試驗用水為去氯自來水，不間斷充氣，水溫13.77±1.77℃，pH值6.71±0.17，溶解氧（DO）為7.13±0.51，每日換水并投放飼料。一周后開始正式實驗，實驗前24h停止喂食，試驗期間不再喂食。

1.4 實驗設計

按實驗得到的克氏原螯蝦氯氰菊酯96hLC50（0.06mg/L）將脅迫濃度設為0-0.060mg/L范圍內的6個濃度，分別是0，0.012，0.024，0.036，0.048和0.060mg/L。同樣地根據吡蟲啉96hLC50（10.98mg/L）將吡蟲啉溶液設為6個濃度，分別為0，2.2，4.4，6.6，8.8和10.98mg/L。每個水族箱隨機挑選10只健康活潑的克氏原螯蝦，脅迫實驗持續進行24h，實驗期間不間斷充氣。

1.5 樣品制備

實驗結束后，從實驗組和對照組分別隨機取出5尾克氏原螯蝦，沖洗后擦干、稱重、在冰塊上快速解剖取出適量鰓組織，剔除附著物，用濾紙吸干表面水分，電子天平稱重后，將所取樣品按其重量分別加入10倍 （w：v）的預冷重蒸水，在-4℃下用研磨成勻漿，取勻漿液用高速冷凍離心機離心（0-4℃，l0000r/min，30min），取上清液作為待測樣液進行酶活性測定，置于4℃冰箱中備用，放置時間不超過24h。

1.6 酶活測定

AChE活性試劑盒采用巰基顯色法，其定義為：每毫克組織蛋白在37℃保溫6分鐘，水解反應體系中1umol基質為1個活力單位（U/mgprot）。

蛋白含量采用Bradford法測定，以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白，單位：g/L。

2 結果與討論

2.1 氯氰菊酯對克氏原螯蝦鰓AChE和Na+-K+-ATPase活性的影響

2.1.1氯氰菊酯對克氏原螯蝦鰓AChE活性的影響

氯氰菊酯脅迫下，克氏原螯蝦乙酰膽堿酯酶活力變化情況見圖1。從圖中可以看出，受試蝦乙酰膽堿酯酶活力變化隨著氯氰菊酯濃度的升高，其活力呈現先上升后下降的趨勢。在0.012mg/L組其活力達到最大，呈現出誘導作用，酶活性較對照組上升了93.8%；0.06mg/L組活性最低，顯示出一定的抑制作用，酶活性降至空白對照組的69.0%， 0.012mg/L處理組和對照組、0.048mg/L、0.060mg/L組間具有顯著性差異（P<0.05）。但除此外，其它處理組和空白對照組之間活性均不具有顯著性差異（P>0.05）。

2.1.2氯氰菊酯對克氏原螯蝦鰓Na+-K+-ATPase活性的影響

從上圖可以看出克氏原螯蝦在亞致死濃度氯氰菊酯脅迫下，其Na+-K+-ATPase的活性變化。隨著暴露濃度的增加， Na+-K+-ATPase活性逐漸下降， 在最高濃度0.06mg/L組，其活性降至最低，僅為空白對照組的27.7%，其它各組的活性分別為空白對照組的64.6%，48.9% 、31.2% 、29.5%，但各處理組及對照組間的活性均無顯著性差異（P>0.05）

2.1.3討論

大量的研究結果表明，環境中的許多有毒物質（農藥、重金屬離子、燃油及工業廢水等），均可能抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）和Na+-K+-ATPase。劉曉宇等報道了敵敵畏、辛硫磷和樂果對鱘魚腦乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用；Galgani等在研究北海大范圍水域中比目魚組織中乙酰膽堿酯酶活性中發現，隨著水域中污染的梯度變化，乙酰膽堿酯酶活性也隨之發生變化；謝卓丘報道溴氰菊酯對大鼠腦AChE的活性無抑制作用，同時周志剛等也認為溴氰菊酯對草魚無顯著影響，但Bendahou N報道溴氰菊酯對蜜蜂AChE活性卻具有顯著降低的作用，商利新在實驗中也得出結論，氯氰菊酯對日本沼蝦乙酰膽堿酯酶（AChE）和Na+-K+-ATPase有明顯的抑制作用。可見隨著不同物種體內的代謝速度、解毒酶活力以及乙酰膽堿酯酶敏感程度不同，它們的耐毒能力大不相同，相同毒物對于不同生物表現出不同的毒性作用。本實驗中結果表明，亞致死濃度的氯氰菊酯脅迫下，受試蝦乙酰膽堿酯酶活力不僅沒有被抑制，反而被誘導，活力相對增強，在氯氰菊酯濃度達到0.036mg/L脅迫時，乙酰膽堿酯酶活力出現下降，但與對照組無顯著差異，可見于亞致死濃度氯氰菊酯對克氏原螯蝦乙酰膽堿酯酶的毒害作用不是很明顯，但對Na+-K+-ATPase活性的影響的比較顯著，隨著脅迫濃度的升高，其活性不斷地下降，表現出一定的劑量-效應關系。說明氯氰菊酯損害了其細胞膜功能，影響受試蝦的水鹽代謝的調節，這與其它報道的結果基本上是一致的。由此可見，低濃度的氯氰菊酯對其神經毒害的作用不明顯，不會抑制受試蝦的乙酰膽堿酯酶活性，但對細胞膜有較明顯的毒性作用，一旦脅迫濃度再升高，必將會導致螯蝦大量死亡。

2.2 吡蟲啉對克氏原螯蝦鰓AchE和Na+-K+-ATPase活性的影響

2.2.1吡蟲啉對克氏原螯蝦鰓AchE活性的影響

圖3說明了克氏原螯蝦隨著吡蟲啉脅迫濃度的增大，其乙酰膽堿酯酶活力的變化情況。從圖中可以得知，受試蝦乙酰膽堿酯酶活力變化與在氯氰菊酯脅迫下所表現出的變化非常相似，也是先上升后下降的趨勢。在2.2mg/L組其活力達到最大，酶活性高出空白對照組59.8%，其誘導作用達到顯著水平（P<0.05），4.4mg/L處理組活性僅低于2.2mg/L處理組，活性高出對照組54.1%，誘導作用也表現出顯著性差異（P<0.05）；11mg/L組活性最低，顯示出一定的抑制作用，酶活性僅為對照組的52.7%，并且11mg/L組和2.2mg/L組間具有顯著性差異（P<0.05）。但各處理組活性與對照組之間不具有顯著性差別（P>0.05）。

2.2.2吡蟲啉對克氏原螯蝦鰓Na+-K+-ATPase活性的影響

亞致死濃度吡蟲啉脅迫對受試克氏原螯蝦 Na+-K+-ATPase活性的影響見上圖。實驗結果表明，隨著脅迫濃度的增加，其活性總體呈現先下降后上升的趨勢，這與氯氰菊酯脅迫后，其Na+-K+-ATPase活性變化有著較大的差別，并且處理組間活性差異顯著（P<0.05），2.2和6.6mg/L兩處理組活性與空白對照組活性存在顯著性差異（P<0.05），8.8mg/L處理組與其它各組間也均表現出顯著性差異（P<0.05）。

2.2.3討論

從之前的一些學者的研究結果知道，絕大多數的有機農藥會抑制水生生物乙酰膽堿酯酶的活性，但在本實驗中，低濃度的吡蟲啉對受試蝦乙酰膽堿酯酶沒有表現出明顯的抑制作用，僅當濃度增加到11mg/L時，其活性才開始被有所抑制，這與氯氰菊酯對克氏原螯蝦乙酰膽堿酯酶的影響結果一致。但對Na+-K+-ATPase酶活性的影響則沒有表現出很明顯的規律性，大致為低濃度時抑制，濃度增加時反而被誘導，活性較對照組高，這與氯氰菊酯對該蝦Na+-K+-ATPase的影響結果有很大的不同，前者是活性隨脅迫濃度的升高，其活性逐漸下降，而后者則為先下降后上升。因此本文認為受試克氏原螯蝦乙酰膽堿酯酶和Na+-K+-ATPase酶對吡蟲啉這種農藥的敏感性不高，這可能與不同生物對不同農藥的解毒酶所起的作用不同有關。至于如何對乙酰膽堿酯酶和Na+-K+-ATPase酶產生抑制和誘導效應，是直接抑制或誘導酶活性還是中毒后引起異常生理變化，還是間接引起酶活性降低，尚有待進一步研究。

3 小結

在系列亞致死濃度的氯氰菊酯和吡蟲啉農藥脅迫下，克氏原螯蝦鰓的乙酰膽堿酯酶和Na+-K+-ATPase酶表現出不同的敏感性。乙酰膽堿酯酶（AChE）在兩種農藥脅迫下均表現為一定的誘導作用，Na+-K+-ATPase酶在氯氰菊酯脅迫下表現為較明顯的抑制作用，但在吡蟲啉脅迫下，活性變化規律不是很明顯，總體為先下降后上升。實驗結果表明，氯氰菊酯和吡蟲啉對克氏原螯蝦神經毒害的作用不明顯，氯氰菊酯對其膜功能有較大的影響，吡蟲啉對膜功能則不具有較強的毒性作用。

參考文獻：

[1]黃婷.氯氰菊酯和吡蟲啉對克氏原螯蝦耗氧率和排氨率的影響[J].科技經濟市場，2011（5）.