結直腸癌有無肝轉移血清差異蛋白質表達的研究

張偉斌　陳丹　馬偉欽　何興祥　陳羽　王麗京

【摘要】 目的：利用蛋白質組學技術分離、鑒定結直腸癌有無肝轉移患者血清中差異蛋白質，篩選診斷肝轉移的血清蛋白標志物。方法：根據入組條件，收集結直腸癌無肝轉移病例、有肝轉移病例，在兩組中隨機抽取12例血清樣本，同組血清等量混合進行雙向凝膠電泳，建立兩組血清蛋白質雙向電泳圖譜，用Image-Master V5.0軟件尋找兩組差異蛋白質點，MALDI-TOF-MS對差異蛋白質進行鑒定，查詢生物信息數據庫對差異蛋白質進行初步分析。結果：兩組比較差異在2倍以上蛋白質有8種，其中5個蛋白質表達上調，3個蛋白質表達下調；兩組每個差異蛋白灰度體平均值比較差異均有統計學意義（P<0.05）。通過數據庫搜索鑒定出7種蛋白質，上調的5個蛋白質分別是Transferrin、Complement component C9、RNA directed DNA polymerase（RNA指導的DNA合成酶）、Conserved hypothetical-protein（假定蛋白質）、SEC14L1 7 kDa protein；下調的2個蛋白質分別是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。結論：結直腸癌有無肝轉移患者血清中的蛋白質表達譜有一定的差異性，這些差異蛋白質可能成為診斷肝轉移的血清標志物。

【關鍵詞】 結直腸癌； 肝轉移； 差異蛋白質

近年來大量統計資料表明，在我國結直腸癌腸癌發病率和死亡率逐年升高盡管診療新技術不斷改進和化療藥物的更新，其整體治療水平仍不盡人意，主要原因是在行根治性手術前出現了肝臟的轉移。因此，早期有效地診斷結直腸癌肝轉移具有重要的臨床意義，是徹底改變結直腸癌預后的關鍵措施。本研究利用蛋白質組學技術篩選及鑒定結直腸癌肝轉移關鍵血清蛋白標志物，進一步了解結直腸癌肝轉移機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年5月-2011年11月本院經病理明確診斷為結直腸癌的患者88例，并且患者既往無其他腫瘤，術前未接受過放療、化療等治療；無姑息性手術者；無肝炎、肝硬化、原發性肝癌以及急慢性炎癥性疾病等影響血清蛋白含量的相關疾病患者。影像學檢查（B超、CT或MRI）檢查發現有肝轉移灶者為結直腸癌有肝轉移組，無發現肝轉移灶者為結直腸癌無肝轉移組。均征得患者同意入組。88例直腸癌患者中直腸癌38例，結腸癌50例；無肝轉移患者62例，伴肝轉移患者26例。結直腸癌無肝轉移組男33例，女29例，平均年齡（55.8±13.8）歲；結直腸癌伴肝轉移組男11例，女15例，平均年齡（58.1±8.7）歲。兩組患者的年齡、性別等比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑、儀器、軟件 硫脲、除高峰度蛋白試劑盒、碳酸鈉（Na2CO3）、碳酸氫鈉，尿素、Tris堿、3-[3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基]丙磺酸鹽、二硫蘇糖醇、溴酚藍、甘油、十二烷基磺酸鈉、過硫酸銨、丙烯酰胺、N，N-亞甲基丙烯酰胺、四甲基乙二胺、低熔點瓊脂糖、固相pH值干膠條、蛋白質純化試劑盒、定量試劑盒、考馬斯亮藍、冰醋酸（glacial acetic acid）、丁醇（butanol）。DU530型核酸/蛋白分析儀（美國 Beckman）；IPGphor等電聚焦儀，Ettan DALT six大型垂直電泳系統、掃描儀ImageScanner和LabScan軟件（Amersham Biosciences）；質譜儀Ultraflex III（美國布魯克）等。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質樣品制備 早晨抽取研究對象空腹靜脈血5 mL于干燥管收集，干燥管編號，記錄患者信息。37 ℃靜置30～60 min，3400 rpm離心15 min，取上層清亮透明血清，在這個過程中應盡量避免發生溶血，如若溶血標本，棄去。每個EP管500 ?L血清分裝，并編號，-80 ℃冰箱保存備用。結直腸癌無肝轉移及伴有肝轉移組分別隨機選取各12例標本，同組標本取等量混合，除高豐度蛋白，Clean-up kit純化后用Quant kit測定蛋白濃度。

1.3.2 雙向電泳 第1向等電聚焦，上樣量總體積為460 ?L（含總蛋白質500 ?g）；以13 200 rpm 4 ℃離心30 min，去上清液；放置IPG膠條并確保膠條與樣品之間無氣泡，膠條吸脹15 min；依次經過30 V 12 h、500 V 1 h、1000 V 1 h、8000 V 6 h、2000 V 10 h。等電聚焦結束后，將IPG膠條置于平衡緩沖液中15 min。將平衡好的膠條轉入垂直電泳槽中進行第2向電泳。后考馬斯亮藍G-250染色對電泳凝膠進行染色。

1.3.3 凝膠圖像掃描與分析 用Image Scanner掃描儀同一參數（300 dpi）掃描并用Image Master V5.0進行圖像分析，對膠上蛋白質斑點通過編輯，背景消除，分析膠間的匹配，獲取差異蛋白點.

1.3.4 差異蛋白點肽質量指紋分析及鑒定 挖取出差異蛋白質點，進行蛋白質膠內酶解后獲得蛋白質酶解肽段，將肽段點樣于MALDI板上，進行MALDI-TOF/TOF-MS鑒定分析。Mascot軟件檢索Human的IPI蛋白質數據庫，參數設置如下：種屬為human，切割酶combined，允許的未酶切位點數為1，酶為胰蛋白酶，MS的誤差30 ppm，MS/MS的誤差為0.2 Da。MS和MS/MS結果聯合搜索，得分超過63分為超過閾值（P<0.05），為可信的鑒定結果，并根據質譜結果，通過數據庫鑒定出蛋白質。

1.4 統計學處理 測定結果輸入計算機，數據采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雙向電泳結果 實驗進行3次重復，銀染顯色后得到兩組共6張背景清晰、分辨率高的銀染凝膠圖譜（圖1、圖2），后用圖像分析軟件Image Master 2D Platinum對圖像進匹配分析。在匹配分析過程中得到具有差異蛋白質局部放大圖（圖3）以及其三維空間圖（圖4）。在匹配分析中選擇差異倍數大于2倍以上為差異蛋白質。分析示有8個差異蛋白質點表達，其中肝轉移組中5個蛋白質點表達上調且大于2倍的，3個蛋白質點表達下調調且大于2倍，并計算8個差異蛋白點3次電泳膠的灰度體平均值，兩組每個差異蛋白灰度體平均值比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。endprint

2.2 差異蛋白質的質譜圖及鑒定 從肝轉移組凝膠中切下的8個差異表蛋白質點，進行MALDI-TOF-MS質譜鑒定，獲取的質譜圖（圖5、圖6）。

并經過Mascot軟件檢索human的IPI蛋白質數據庫，按Mascot得分、匹配的片段數和覆蓋率等進行綜合評判搜索結果見表2。

3 討論

近年來利用手術切除標本、患者血液、腫瘤細胞等作為研究對象，發現結直腸癌肝轉移與多種蛋白有關[1]。結直腸癌在向肝轉移過程中癌組織會分泌多種蛋白質入血清，而其他器官和組織受到腫瘤影響也會分泌蛋白質，因此從血清蛋白質組學角度進行研究很可能會發現一些與腫瘤發生發展相關的特異性血清標志物，目前利用血清蛋白質組學研究腫瘤發生和轉移癌癥的有乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等[2-5]。本研究利用蛋白質組學技術分離、鑒定結直腸癌有無肝轉移患者血清中差異蛋白質，并通過數據庫搜索鑒定出8種蛋白質（其中有2個蛋白質同為Haptoglobin），5個上調的蛋白質分別是Transferrin、Complement component C9、RNA directed DNA polymerase（RNA指導的DNA合成酶）、Conserved hypothetical -protein（假定蛋白質）、SEC14L1 7 kDa protein；2個下調的蛋白質分別是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。

Transferrin產生的主要器官是肝臟，它是一種重要的β-球蛋白，是體液中不可缺少的成分，是細胞生長和增殖所必需的生長因子。有報道發現，Transferrin能改變細胞的黏附能力，促進腫瘤的復發和轉移，并且在腫瘤和癌細胞中Transferrin的受體含量顯著高于其相應的正常細胞[6-7]。另有研究通過對高危乳腺癌的術后血清進行SELDI-TOF MS表達譜分析，發現復發轉移后血清中蛋白質Transferrin上調，提示其對轉移具有獨立預后意義[8]。李祖國等[9]通過建立裸鼠結直腸癌肝轉移模型并應用血清蛋白質組學技術觀察肝轉移前后血清蛋白的變化，結果示結直腸癌肝轉移后血清中Transferrin顯著上調。所以筆者分析當結直腸癌細胞生長時，其表面Transferrin受體的密度迅速增加，待攜帶受體的癌細胞浸潤入血后，與在肝臟產生Transferrin結合并沉積在肝臟形成轉移，Transferrin可能是促進結直腸癌轉移相關的蛋白。另一種上調的蛋白質RNA-directed DNA polymerase是逆轉錄酶，目前認為是正常細胞轉化為惡性細胞的關鍵因素，已經有學者通過實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測結直腸癌患者外周血人端粒酶逆轉錄酶表達率和表達水平顯著增高，可作為結直腸癌肝轉移的標記物[10]。下一步也可通過熒光定量等技術檢測肝轉移組血清RNA directed D-polymerase上調的表達率和表達水平，為監測結直腸癌肝轉移篩選一個可靠的蛋白標志物。上調的Complement component C9是一種非特異性蛋白，在腫瘤免疫中作用受到重視，研究表明肝癌患者血清C9水平明顯升高，可作為AFP陰性肝癌敏感的、特異的腫瘤標志物之一[11]。本研究中結直腸癌有肝轉移患者血清中上調倍數最大的蛋白質是Conserved hypothetical protein，它是通過直接測序或由cDNA序列翻譯之后，得到的蛋白質序列，該序列中存在有某種特定功能的一段保守序列，筆者推測這段保守序列的特定功能可能是引起結直腸癌肝轉移的關鍵步驟，將對其重點研究。

在本研究中發現結直腸癌有肝轉移患者血清中下調的蛋白質是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。Haptoglobin是血清中的一種酸性糖蛋白，廣泛存在于人類的血清中，其功能是作為一種急性期蛋白，在參與宿主抗感染、損傷組織的修復以及內環境穩定的過程中起著重要作用，其在感染、創傷、炎癥、腫瘤、心肌梗死等病理狀態時顯著升高。其能促進新生血管的內皮細胞生長和分化[12-13]。另它能通過與游離血紅蛋白結合形成復合物，復合物運至肝臟后它就迅速被肝細胞從血液清除并釋放血紅蛋白，可導致其降低，所以有研究報道肝硬化癌變過程Haptoglobin由高到低[14-15]。本研究結果示Haptoglobin降低，結合其功能，筆者推測在結直腸癌患者未發生肝轉移時期，Haptoglobin促進腫瘤血管生成，當腫瘤血管生成達到一定程度時，Haptoglobin與游離血紅蛋白結合形成復合物攜帶腫瘤細胞入血，經過肝臟時復合物中的Haptoglobin被肝細胞清除，血清中Haptoglobin降低，但腫瘤細胞定植在肝臟形成轉移瘤。而本研究特殊情況是Haptoglobin在雙向電泳中顯示為不同的位置，說明結直腸癌肝轉移過程可能還同時伴有蛋白質修飾的改變參與其中。另下調蛋白質Isoform 1 of Serum albumin是血清白蛋白的異構體，白蛋白屬于非急性時相蛋白，在維持血液膠體滲透壓，體內代謝物質轉運及營養等方面起著重要的作用，即使肝臟停止合成，8 d后外周血中濃度僅降低20%，由于肝臟有很強的代償能力，半衰期較長，只有當肝臟病變和病程達到一定程度后才能出現白蛋白的改變。本研究示當結直腸癌出現肝轉移時Isoform 1 of Serum albumin下調，考慮肝轉移后肝細胞受到破壞，即引起其變化，如定期監測，就可早期發現有無肝轉移，但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，結直腸腸癌肝轉移的形成是一個多步驟的復雜過程，涉及到多個基因和多個蛋白的相互協同或拮抗作用。本研究的8種差異蛋白質可能在結直腸癌肝轉移相關基因的突變、激活，癌細胞的粘附、遷移、增殖，細胞外基質降解，組織免疫性及腫瘤血管增生因子等過程中起到一定作用。筆者已經將2種差異蛋白質Transferrin、Haptoglobin構建人工神經網絡模型，建立結直腸癌肝轉移診斷模型，并通過橫斷面驗證其有較高的準確度。故對這些差異蛋白質的進一步研究，便可早期篩選結直腸癌肝轉移的血清標志物。endprint

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（收稿日期：2014-05-03）（本文編輯：蔡元元）endprint

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（收稿日期：2014-05-03）（本文編輯：蔡元元）endprint