CRISPR/Cas基因組靶向編輯技術綜述

賈良杰

陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710119

CRISPR/Cas基因組靶向編輯技術綜述

賈良杰

陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710119

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）是細菌特有的一種獲得性免疫系統，研究人員將其改造成為靶向基因組編輯的工具，由于操作簡單、成功率高且效率高，成為了靶向基因組編輯工具中的佼佼者。同時CRISPR/Cas系統也被改造作為一種極為有效的位點特異性的轉錄抑制/激活的工具而在研究工作中廣泛應用，不僅如此，具有靶向細胞轉錄過程中產生的RNA底物的利用前景，從而起到與RNAi技術相類似的效果。CRISPR-Cas技術已經在基因功能研究、動物模型建立、基因治療等領域得到廣泛的推廣和應用，有力地推動了相關領域的研究進展。

基因靶向修飾技術；Cas9；CRISPR/Cas；基因組編輯；基因治療

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系統是一種原核生物特有的針對外源性遺傳物質免疫系統，通過序列特異的RNA介導，切割降解外源性DNA，這些外源性遺傳物質包括噬菌體或者外源性質粒[1]。CRISPR/Cas系統可分為三種類型，其中類型ⅡCRISPR/Cas系統由于其組成簡單，被改造成為基因組靶向編輯的工具。在類型ⅡCRISPR/Cas系統中，CRISPR能夠轉錄產生前體crRNA（Pre-CRISPR RNA，Pre-crRNA），Pre-crRNA經過Cas9-tracrRNA復合物加工后產生成熟的crRNA（CRISPR RNA），crRNA的5′端區域能夠與靶位點互補配對，而其3′端能夠與tracrRNA（trans-activating crRNA）及Cas9蛋白形成復合物，從而引導Cas9蛋白結合于靶位點進行特異性地切割。CRISPR/ Cas系統與其他外源核酸防御系統（如限制修飾系統）最重要的區別在于：CRISPR/Cas系統具有記憶性，細菌會記憶首次入侵外源核酸的信息，在其再次入侵時，特異性的識別并切割這些外源核酸酶使其降解，保護自身遺傳物質的完整準確[1]。特異的Cas蛋白會識別外源性的遺傳物質中具有原型間隔序列毗鄰區（protospacer adjacent motifs，PAM）的DNA片段，通過Cas蛋白將PAM5′端的DNA（即原型間隔序列）加工成短的DNA片段，插入到其CRISPR序列的重復序列之間，最終使得細菌通過spacer序列識別并且隨后靶向這些外來原件進行切除[2]。

類型ⅡCRISPR/Cas系統組成最為簡單，只需要Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA、RNaseⅢ四種成分即可發揮作用[3]。在這一系統中，Cas9蛋白在crRNA的加工以及對外源DNA的特異性切割中都發揮著重要的作用[4]。因此本綜述也主要介紹針對類型ⅡCRISPR/Cas改造而來的相關技術。

1 CRISPR/Cas系統可以作為一種位點特異性基因編輯平臺

CRISPR/Cas系統作為一種具有位點特異性的基因編輯系統，其最大的特點在于操作簡單，這是因為其識別的特異性是有crRNA序列決定的。有報道稱，可以通過人工合成crRNA序列使得Cas9系統識別并結合到與該crRNA互補的DNA序列上，最終介導Cas9蛋白特異性的切割該雜交區域[5]。與crRNA互補的靶位點序列稱為原型間隔序列，除了與crRNA存在互補序列外，在互補序列的毗鄰區還必須存在原型間隔序列毗鄰區（proto-spacer adjacent motif，PAM）。PAM序列對于Cas9系統能夠有效穩定的發揮作用有著重要的意義，其使得雙鏈RNA復合體與靶序列精準的結合，并有效地避免了自身結合現象的發生。

在Cas9系統發揮識別剪切過程中，tracrRNA首先與crRNA形成crRNA：tracrRNA復合體，Cas9蛋白識別并與crRNA：tracrRNA復合體結合，在crRNA的引導下識別并切割靶位點。為了進一步簡化操作過程，研究人員依據cr-RNA：tracrRNA復合體的結構特征設計了sgRNA（single guide RNA），sgRNA具備crRNA：tracrRNA復合體的功能，能夠被Cas9蛋白識別并引導Cas9蛋白結合于靶位點[5]。

上述Cas9所具有的這些優點使得其能夠成為一種跨平臺的基因編輯工具在多種實驗模型中發揮價值。最新的研究結果顯示，Cas9作為一種基因組編輯工具已經成功的應用在細菌、酵母、植物、線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠和人的細胞模型之中（既包括傳代細胞系和干細胞中）[5-7]{Cong，2013#427}{Cong，2013#427}{Mali，2013#409}{Mali，2013#409} {Cong，2013#425}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}。這說明了它是一種多物種適應性的，位點特異性的有效基因組編輯工具。Cas9-sgRNA在靶位點切割產生雙鏈DNA斷裂（Double strand break，DSB）后，細胞可以通過兩種方式對DNA進行修復，非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復方式和同源重組方式（homology-directed repair，HDR）。非同源末端連接往往使得核酸鏈被剪切的區域發生基因突變，導致編碼的基因會喪失功能[8-9]。而同源重組往往通過供體DNA與基因組DNA之間的同源重組造成靶位點的糾正或者靶向插入外源基因[8-9]。

由于sgRNA對靶序列識別的長度只有20個堿基，且Cas9蛋白對sgRNA 5′端序列與靶位點的錯配不敏感，這使得Cas9-sgRNA技術的脫靶率比較高。為了提高該技術打靶的特異性，一種突變型的Cas9蛋白（Cas9 D10A）被構建出來[8-9]。這種突變型的Cas9核酸內切酶是將Cas9蛋白的兩個核酸內切酶結構域之中的一個（RuvC-Ⅰ）經過點突變的從而失活，另一個切割結構域被保留，從而使得目標序列形成單鏈斷裂（nicked DNA）[5]。這樣需要有結合于兩條互補的DNA鏈上相鄰位置的一對sgRNA同時引導Cas9 D10A識別并切割靶位點才能造成DSB，從而加大了識別的長度，有效的提高了Cas9-sgRNA技術的特異性[8-9]。

2 利用Cas9系統在轉錄水平對基因表達的調節

Cas9-sgRNA作為一種能夠與靶位點特異性識別并切割的技術，其用途不僅限于對靶位點的靶向編輯。通過點突變使Cas9蛋白的兩個核酸內切酶結構域活性全部喪失獲得dCas9，但是dCas9仍保留了與靶位點特異性結合的能力，這樣將dCas9-sgRNA作為與DNA特異性識別的平臺，同樣具有很大的應用價值[5，10]。dCas9-sgRNA結合與DNA上，阻斷該位點上基因的轉錄，可以起到轉錄抑制的效果。如果在dCas9的C端融合轉錄抑制結構域KRAB（Krüppel associated box），獲得的dCas9-KRAB-sgRNA具有更強的轉錄抑制效果，將可以替代脫靶效應明顯的siRNA技術。如果在dCas9的C端融合轉錄激活結構域p65AD，則可獲得能激活特定基因轉錄的轉錄因子[10]。通過以上這兩個方面的改造可以使Cas9-sgRNA成為對基因表達的調控工具。由于原核表達系統中，需要依賴于誘導與阻遏調控機制，相反，真核生物中，調控的方式是散在的協同調控方法。所以當我們設計在原核生物中表達一個真核生物的基因或是在真核生物中表達一個原核生物的基因時，這就需要在基因序列前附加一個新的啟動子和具有調控作用的小分子進行轉錄水平的調控，甚至需要對于特定的基因序列設計相應的增強子來對于目標基因的表達進行調控，而利用dCas9-激活或抑制系統就可以繞過這些繁瑣的步驟[11-13]。

3 利用Cas9系統對目標RNA序列進行操縱

最近，相關研究證明了病原體Francisella novicida基因組中編碼的Cas9核酸內切酶能夠引起一個位點特異性的轉錄抑制作用[14]。該文章報道了通過tracrRNA和一種新型的小RNA（small CRISPR/Cas-associated RNA，scaRNA）所介導，F.novicida Cas9（FnCas9）能夠與靶向的mRNA相結合，從而進一步發生反應的過程。隨后，這種Cas9-scaRNA-tracrRNA-mRNA復合結構的各組分之間互作導致了mRNA穩定性衰減從而將靶序列的表達量降低。以此可以推測FnCas9或可能其他的Cas9系統將可以很容易的被介導靶向RNA。事實上，實驗還為研究Cas9系統優先靶向RNA或DNA的機制方面提供了啟發，也就是FnCas9系統作為Cas9系統的一個個例，具有較強的結構特異性和序列需求性。

FnCas9系統靶向特定的RNA序列原理做出第一種推測是，FnCas9系統自身結構的特殊性決定了功能。在目前已知的蛋白結構中沒有一個是可以通過保守殘基與靶向mRNA結合的[14]。相反，在FnCas9系統中存在一個精氨酸富集基元（arginine-rich motif，ARM）結構域，并被證明是在其結合mRNA的過程中發揮了重要的作用[12]。FnCas9系統可能在tracrRNA和mRNA中間形成了一個簡單的腳手架結構，這個結構促使了靶向的核酸內切酶對目標區域RNA的降解[15]。另一種推測是介導RNA和靶向RNA之間的非同源性互作下進行識別并結合。實驗證實，這個現象在病原體F.novicida中出現，tracrRNA上與mRNA反向互補的同源序列和非同源序列相互交錯結合，從而形成tracr-RNA-mRNA復合物。

這項新的技術一經提出，預示著FnCas9將會代替shRNA（short hairpin RNA）/siRNA等傳統RNAi（small interfering RNA）技術成為一種新型的RNA干擾物而對于不同種類的細胞及動物模型中特定的基因的下游產物進行RNA干擾[16]。在目前的研究成果看來，并不能確定此系統能否穩定地在真核生物的細胞之中都能發揮降解RNA的作用[23]。當然，FnCas9系統也并不是唯一一個能夠與mRNA結合產生干擾作用的Cas9系統一種存在于Pyrococcus furiosus的CRISPR/Cas蛋白亞型（Ⅲ型）被證明可以靶向消化RNA底物[16]。研究發現，與先前提到的FnCas9相比，這一系統所能夠識別并干擾的RNA序列更長，也就表明，這一系統與基于Cas9系統的FnCas9干擾物相比有更高的特異性，這一平臺的發現將極大促進RNAi技術的進步。

4 展望及結語

到目前為止對CRISPR/Cas9技術的開發尚屬初步。首先，雖然Cas9系統會被sgRNA引導從而識別出靶序列，但脫靶效應依然存在[11]。為了減少脫靶效應，研究人員得出了很多方法改變現狀，如通過改變sgRNA的二級結構、改變sgRNA的長度、或是通過互補的切口酶預先制造雙鏈DNA斷裂，這都能有效地減少脫靶效應[11，17-19]。另外，PAM區域與靶片段的同源序列的長短也在近期被報道，在對于Neisseriameningitidis中的Cas9系統（NmCas9）的PAM序列的特異性分析的報道中我們就可以發現，NmCas9系統的PAM區域（5′-NNNNGATT-3′）與Streptococcus thermophilus中的Cas9系統的PAM區域（5′-NNAGAAW-3′）比Streptococcus pyogenes Cas9（5′-NGG-3′）對PAM區域配對的要求嚴格的多[5，8，20]。

從最開始認識到CRISPR作為細菌和古細菌的一種免疫系統，到之后通過觀察到這種獲得性的免疫能力的細菌或是古細菌也能夠生存下來并能將免疫能力傳遞給下一代，認識到CRISPR/Cas9是一種能夠遺傳的免疫系統，這完美地驗證了拉馬克的獲得性遺傳理論[21]。通過這種在原核生物中發現的遺傳物質靶向操作系統，現在能夠很快速地對遺傳物質進行操作或修飾，無論是在細胞系中還是在模式動物的胚胎中[22]。CRISPR/Cas9系統在基因治療方面能夠發揮較大的作用。通過導入Cas9系統和相應的靶向致病基因的sgRNA載體，來對遺傳缺陷進行糾正或刪除，這種技術將在未來幾十年之內將會逐步成為一種可靠地治療手段。當然，與成熟的ZFN和TALEN等遺傳物質靶向編輯系統相比，CRISPR/Cas9核酸內切酶系統具有得天獨厚的優越性，其優越性體現在如構建簡單方便快捷、安全性高、毒性小等方面。CRISPR/Cas9系統在臨床治療、基礎理論研究和農牧漁業等領域必將會發揮巨大的作用，并且將會對分子生物學研究和基因治療領域產生深遠的影響。

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Review about CRISPR/Cas system as a new targeted genome editing technology

JIA Liangjie
College of Life Sciences,Shaanxi Normal University,Shaanxi Province,Xi′an 710119,China

CRISPR(clustered,regularly interspaced,short,palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)systems are a unique prokaryotic defense against foreign genetic elements.It also be considered as a targeted genome editing tool in molecular biology research.Because of its simplicity,high success rate and high efficiency in genome targeting,Cas system became the best genome targeting tools compared with ZFNs(Zinc-finger nucleases)and TALENs(Transcription activator-like effector nucleases).According to the recent researches,Cas system could be used as an efficient system for site-specific transcriptional repression or activation.Additionally,a specific Cas9 protein has been observed to target an RNA substrate,suggesting that Cas9 may have the same ability as RNAi technology to be programmed to target RNA aswell.Overall,the targeted genome editing technology via CRISPR/Cas system has been Widely promoted and applied in many field such as the research on gene functions,the the diseasemodel of gene knock-out animal construction and the gene therapy.So itwill have significant impacton future advancements in genome engineering.

Gene targeting;Cas9;CRISPR/Cas;Genome editing;Gene therapy

Q78

A

1673-7210（2014）08（a）-0154-04

2014-05-12本文編輯：衛軻）

國家級大學生創新創業訓練計劃項目（編號201310718020）。