HPLC測定戊己丸中4種生物堿類成分的含量△

李俊健，吳永成，宋粉云

(廣東藥學院 藥科學院，廣東 廣州 510006)

HPLC測定戊己丸中4種生物堿類成分的含量△

李俊健，吳永成，宋粉云*

(廣東藥學院 藥科學院，廣東 廣州 510006)

目的：建立測定戊己丸中4種生物堿類成分含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法，固定相為Diamonsil-C18柱，乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(48∶52)(每100 mL中加入十二烷基硫酸鈉0.4 g)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為284 nm，柱溫為25 ℃。結果：鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀分別在5.0～50.0，0.4～4.0，2.0～20.0，2.0～20.0 g·mL-1呈良好的線性關系；平均回收率分別為102.4%，100.1%，100.0%，102.0%；方法精密度RSD分別為0.36%，1.50%，1.60%，0.86%(n=6)。結論：該法可用于戊己丸的質量控制。

戊己丸；鹽酸小檗堿；鹽酸表小檗堿；鹽酸黃連堿；鹽酸巴馬汀；反相高效液相色譜法；含量測定

戊己丸是由黃連、吳茱萸(制)、白芍(炒)3味中藥制成的中藥成方制劑，具有瀉肝和胃，降逆止嘔之功效。臨床用于肝火犯胃、肝胃不和所致的胃脘灼熱疼痛、嘔吐吞酸、口苦嘈雜、腹痛泄瀉等癥的治療。其現行標準采用HPLC測定鹽酸小檗堿和芍藥苷的含量[1]。已有HPLC測定鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿和吳茱萸次堿等含量的報道[2-5]，但同時測定鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀的含量測定未見文獻報道。黃連為方中主藥，其主要成分為生物堿[6]，其中鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀為《中國藥典》2010年版黃連含量測定指標成分[1]。為進一步評價戊己丸的質量，筆者建立了戊己丸中鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀4種生物堿類成分含量測定的反相高效液相色譜法，具有分離效果好、靈敏、準確等優點，可用于該制劑的質量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(安捷倫公司)，Agilent 1100系列雙元泵，Agilent 1100可變波長檢測器，Agilent 1100/化學工作站；KQ-400KDB型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，工作頻率100 kHz，輸出功率400 W。

鹽酸小檗堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-200609)，鹽酸表小檗堿對照品(上海華壹生物科技有限公司，經峰面積歸一化法測定[1]，含量為98.2%)，鹽酸黃連堿對照品(上海華壹生物科技有限公司，經峰面積歸一化法測定[1]，含量為98.3%)，鹽酸巴馬汀對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110732-201108)；戊己丸(李時珍醫藥集團有限公司，批號：201102001，201009007，201109008)。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 樣品液制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為250 μg·mL-1的鹽酸小檗堿對照品貯備液。精密稱取鹽酸黃連堿對照品10.2 mg、鹽酸巴馬汀對照品10.0 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀質量濃度分別為100，100 μg·mL-1的對照品貯備液。精密稱取鹽酸表小檗堿對照品5.1 mg置250 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得鹽酸表小檗堿質量濃度為20.0 μg·mL-1的對照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約0.05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，續濾液0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照品溶液的制備 取處方組成中除黃連外的其余成分制成不含黃連的陰性對照品，按2.1.2項下的制備方法處理得陰性對照液。

2.2 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱為Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司)，乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(48∶52)(每100 mL加0.4 g十二烷基硫酸鈉)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為284 nm，柱溫為室溫。分別取對照品溶液(鹽酸小檗堿質量濃度為20.0 μg·mL-1、鹽酸表小檗堿質量濃度為1.6 μg·mL-1、鹽酸黃連堿質量濃度為8.0 μg·mL-1、鹽酸巴馬汀質量濃度為8.0 μg·mL-1)、供試品溶液和陰性對照溶液10 μL注入液相色譜儀，理論板數以鹽酸小檗堿峰計算應不低于5 000，鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿保留時間分別為20.0，22.7，26.5，30.8 min，與其他組分峰的分離度大于1.5；陰性樣品不干擾樣品測定，見圖1。

1.鹽酸表小檗堿 2.鹽酸黃連堿 3.鹽酸巴馬汀 4.鹽酸小檗堿A.對照品 B.樣品 C.陰性對照品圖1 戊己丸及對照品HPLC圖

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線制備 分別吸取一定量的對照品貯備液，加甲醇稀釋成鹽酸小檗堿質量濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，50.0 μg·mL-1，鹽酸表小檗堿質量濃度為0.4，0.8，1.6，3.2，4.0 μg·mL-1，鹽酸黃連堿質量濃度為2.0，4.0，8.0，16.0，20.0 μg·mL-1，鹽酸巴馬汀質量濃度為2.0，4.0，8.0，16.0，20.0 μg·mL-1的系列對照品溶液。依次進樣10 μL，每個濃度測定3次以上。以峰面積(Y)對對照品溶液系列質量濃度(X)進行回歸，得鹽酸小檗堿回歸方程Y=20.69X-7.13，r=0.999 9；鹽酸表小檗堿回歸方程Y=63.27X+0.26，r=0.999 7；鹽酸黃連堿回歸方程Y=20.24X-4.11，r=0.999 8；鹽酸巴馬汀回歸方程Y=28.20X-4.20，r=0.999 9。表明鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀分別在5.0～50.0,0.4～4.0,2.0～20.0,2.0～20.0 μg·mL-1與峰面積線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 取鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀質量濃度分別為20.0，1.6，8.0，8.0 μg·mL-1的對照品溶液10 μL，連續測定5次，其峰面積的平均值分別為401.5，103.0，157.1，220.0，RSD分別為1.06%，1.54%，0.75%，1.59%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取供試品溶液(批號：201102001)在0，2，4，6，8，12 h 分別進樣10 μL，記錄峰面積，結果鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀峰面積的平均值分別為639.0，114.5，156.1，171.6，RSD分別為1.83%，1.86%，1.58%，1.77%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 取同一批號(批號：201102001)樣品6份，按2.1.2方法提取、測定，結果鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀的平均含量分別為29.391，1.716，7.412，5.932 mg·g-1，RSD分別為0.36%，1.50%，1.60%，0.86%，表明分析方法精密度良好。

2.3.5 加樣回收試驗 精密稱取同一批號樣品(批號：201102001)約0.025 g共6份，加入相應量的4種對照品貯備液，按2.1.2方法處理并測定，計算鹽酸小檗堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀的回收率，結果表明本方法準確可靠。見表 1～4。

2.4 樣品含量測定

取戊己丸樣品3批，照2.1.2方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，計算樣品中4種生物堿類成分的含量，結果見表5。

表1 戊己丸中鹽酸小檗堿回收率試驗

表2 戊己丸中鹽酸表小檗堿回收率試驗

表3 戊己丸中鹽酸黃連堿回收率試驗

表4 戊己丸中鹽酸巴馬汀回收率試驗

表5 戊己丸中樣品含量測定(n=3) /mg·g-1

3 討論

黃連及其制劑中生物堿類成分的提取溶劑一般為鹽酸-甲醇[1]，筆者參照文獻報道的戊己丸中鹽酸小檗堿提取方法[1]，以鹽酸-甲醇(1∶100)為溶劑進行提取，比較了加熱回流與超聲提取對提取率的影響，并考察了超聲提取時間對提取的影響，最終確定超聲提取30 min，本法簡單、提取率高。

黃連及其制劑中生物堿類成分的HPLC含量測定，檢測波長主要采用345 nm和265 nm[1]。經考察發現，在上述波長下干擾較大，在284 nm下，4種生物堿的吸收都比較大，而且干擾小，故選擇284 nm作為檢測波長。

黃連中生物堿屬于季銨堿，因此其測定采用離子對色譜法，流動相中加入離子對試劑十二烷基硫酸鈉，參照文獻[1，7-8]考察了乙腈和磷酸二氫鉀的比例及十二烷基硫酸鈉的加入量對分離的影響，發現乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(48∶52)(每100 mL加0.4 g十二烷基硫酸鈉)為流動相分離效果最好。

筆者采用離子對反相高效液相色譜法測定戊己丸中4種生物堿的含量，方法學驗證表明，其精密度、準確度、重復性均能滿足定量的要求，故本方法可用于戊己丸的質量控制。

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Determination of 4 Kind Alkaloids in Wuji Wan by HPLC

LI Junjian，WU Yongcheng，SONG Fenyun*

(SchoolofPharmacy，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China)

Objective：To establish a method for the determination of 4 kind alkaloids in Wuji Wan.Methods：HPLC method was established.The chromatographic column was Diamonsil-C18.The mobile phase was a mixture of acetonitrile-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate(48∶52，V/Vcontaining 0.4 g sodium laurylsulfate per 100 mL).The flow rate was 1.0 mL·min-1，and the detection wavelength was 284 nm.Results：The calibration curves for berberine hydrochloride，epiberberine hydrochloric，coptisine hydrochloride，palmatine hydrochloride were linear in the concentration range of 5.0-50.0，0.4-4.0，2.0-20.0，2.0-20.0 g·mL-1，respectively.The average recoveries for berberine hydrochloride，epiberberine hydrochloric，coptisine hydrochloride，palmatine hydrochloride were 102.4%，100.1%，100.0%，102.0%，respectively.Precision of the method was 0.36%，1.50%，1.60%，0.86%(RSD，n=6)，respectively.Conclusion：The method can be used for quantitative determining of Wuji Wan.

Wuji Wan；Berberine；Epiberberine；Coptisine；Palmatine；RP-HPLC；Quantitative determining

廣東省自然科學基金項目(5002841)

*[通信作者] 宋粉云，教授，碩士生導師，研究方向：現代分析方法在中藥質量控制中的應用研究；E-mail：fuhaiwu@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.014

2013-05-15)