高效液相色譜法測定稻米中二甲戊靈殘留的研究

周天倚，楊仁斌，龍智勇

（1.湖南農業大學農業環保研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南大學環境科學與工程學院，湖南 長沙 410082）

二甲戊靈，又名二甲戊樂靈，化學名稱：N-1-（乙基丙基）-2，6-二硝基-3，4-二甲基苯胺[N-（1-ethylpropy）-3，4-dimethyl-2，6-dinitrobenzenamine]，分子式C13H19N3O4，分子量為281.3，結構式見圖1[1]；其在水中的溶解度為 0.5 mg/L，熔點為54～58℃；該藥在130℃以下的環境下化學性質穩定，揮發性小，不易光解，易溶于丙酮、二甲苯等大多數有機溶劑，屬于二硝基苯胺類除草劑[2]。

圖1 二甲戊靈結構式Fig.1 The chemical structure of Pendimethalin

二甲戊靈是一種新型的低毒高效旱田除草劑，主要適用于防除玉米、大豆、小麥、花生和棉花等多種旱地作物的馬唐、狗尾草、金狗尾草等1年生禾本科和闊葉雜草[3]；其作用機理主要是通過抑制雜草芽和根的分生組織分裂，使其不能生長而死亡[4]。目前，該除草劑也在多種蔬菜和果樹上使用[5]。

近年來，由于該除草劑的廣泛使用，因而對其分析研究也日漸增多。例如：二甲戊靈在豆類[6-7]、青菜[8]、大蒜[9]及水果[10]中的殘留分析研究，以及二甲戊靈的藥理作用[11-15]和毒理作用[16-17]研究等。目前，用于二甲戊靈殘留分析的主要方法有固相分離反相液相色譜法[15]、高效液相色譜法[18-20]、毛細管氣相色譜法[21]和氣相色譜法[22]等，但二甲戊靈在稻米中的殘留分析方法還未見報道。試驗采用高效液相色譜法檢測稻米中的二甲戊靈，旨在建立一種適用于我國實驗室條件的稻米中二甲戊靈的殘留檢測分析方法，為開展二甲戊靈在水稻中的殘留毒理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗主要試劑：二甲戊靈標準樣品（純度為99.6%，農業部農藥鑒定所），甲醇（色譜純和分析純），丙酮、石油醚、二氯甲烷（均為分析純），無水硫酸鈉（600℃條件下烘8 h，分析純），弗羅里硅土（60～100目，分析純）。供試稻米為先農1號，采自湖南農業大學實驗基地。

試驗主要儀器：SPD-20A高效液相色譜儀（配紫外檢測器和工作站，自帶安捷倫Exlend C18不銹鋼柱，5 μm×250 mm×4.6 mm，美國Agilent科技有限公司）；AEU-210萬分之一分析天平（廈門欣銳儀器儀表有限公司）；KQ-100E超聲波洗滌儀（昆山市超聲波儀器有限公司）；KYC-1102C恒溫振蕩儀（上海福瑪實驗設備有限公司）；RE-2000旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；棕色容量瓶（100 mL）及具塞三角瓶（250 mL）等實驗室常用儀器設備。

1.2 試驗方法

1.2.1 二甲戊靈的提取與凈化 準確稱取10 g稻米于250 mL具塞三角瓶中，準確加入50 mL分析純甲醇，在恒溫振蕩儀上30℃振蕩提取1 h后取出冷卻至室溫；經減壓抽濾過濾，提取液經旋轉蒸發儀濃縮至近干；加少量淋洗液（V石油醚︰V二氯甲烷= 75︰25）在超聲波作用下溶解；再定量轉移到層析柱（層析柱從下至上依次填有棉花、2 cm無水硫酸鈉、5 g弗羅里硅土、2 cm無水硫酸鈉，填充好的柱子先用10 mL石油醚潤濕淋洗柱子）上，用40 mL淋洗液（同上）淋洗層析柱；收集全部淋出液在旋轉蒸發儀中濃縮至近干，用色譜甲醇溶解并過0.22 μm有機膜后定容至5 mL，待HPLC測定。

1.2.2 二甲戊靈標準溶液的配制 準確稱取0.526 g二甲戊靈標準樣品，用色譜甲醇溶解并轉至100 mL棕色容量瓶中，配成500 mg/L的母液備用；用梯度稀釋法分別配制2.500、1.250、0.500、0.250、0.125、0.050 的mg/L系列二甲戊靈標準溶液。

1.2.3 HPLC檢測條件 （1）檢測波長：用SPD-20高效液相色譜儀在200～400 nm波長范圍內對0.5 mg/L的二甲戊靈標準溶液進行紫外掃描，綜合考慮分離度、峰形、保留時間等因素來選擇最佳測試波長。（2）流動相：固定高效色譜儀的柱溫（30℃）、檢測波長（238 nm）、流速（1 mL/min）等條件，在流動相的比例V甲醇︰V水=70︰30～90︰10的范圍內選定若干個不同體積比的流動相，對濃度為0.5 mg/L的二甲戊靈標液進行檢測，綜合考慮分離度、峰形、保留時間等因素來選擇最優的流動相配比。（3）柱溫：固定高效色譜儀的檢測波長（238 nm）、流動相比例（V甲醇︰V水=85︰15）及流速（1 mL/min）等檢測條件，在20～40℃范圍內依次遞增5℃對0.5 mg/L的二甲戊靈標液進行檢測，綜合考慮分離度、峰形、保留時間等因素來確定最優的檢測溫度。

1.2.4 標準曲線繪制 將不同濃度的二甲戊靈標準溶液，在最佳檢測條件下測定，以二甲戊靈進樣濃度與相對應的色譜峰面積作標準曲線。

1.2.5 檢測方法精密度的測定 在最佳檢測條下對添加了0.5 mg/L二甲戊靈標準溶液的稻米樣品連續測定5次，對峰面積數據進行統計分析，根據變異系數來衡量方法的精密度。

1.2.6 添加回收試驗 在空白稻米樣品中加入0.1、0.2、2.0 mg/kg 的二甲戊靈標準溶液，按上述方法提取、凈化、濃縮、定容、檢測，每個添加濃度重復5次，計算添加回收率，并作統計分析。

2 結果與討論

2.1 最佳檢測波長

由圖2可知，波長在238 nm和248 nm時，干擾較小，峰形較完整；但波長為238 nm時峰面積大于波長為248 nm時的峰面積，因此選擇238 nm為該方法的最佳檢測波長。

2.2 最佳流動相比例

根據出峰的時間和與雜質的分離程度，從圖3中可看出，在甲醇與水的體積比為75︰25和80︰20時，二甲戊靈不能出峰（峰面積幾乎為零）；而比例為85︰15和90︰10時，峰的分離程度較好，但比例為85︰15時的峰面積明顯比90︰10時的大，表明在V甲醇︰V水=85︰15時，對二甲戊靈的靈敏度較高，更有利于低濃度二甲戊靈的檢測；同時，V甲醇︰V水=90︰10時，出峰時間在6.4 min，容易受到樣品中雜質峰的干擾，影響到測定結果。因此，選擇V甲醇︰V水=85︰15作為該方法的最佳流動相比例。

2.3 柱溫的確定

從表1中看出，在不同柱溫條件下，出峰時間和峰面積有一定的差異，其中以20和25℃時，峰面積較大，但是其出峰時間較遲，容易與雜質峰重疊。因此，綜合考慮之后確定30℃為最佳柱溫。該試驗結果與李永新等[19]的研究結果一致。

圖2 在不同檢測波長下二甲戊靈標準液的色譜圖Fig.2 Chromatography of Pendimethalin under different wavelength

圖3 流動相比例不同時二甲戊靈的色譜圖Fig.3 Chromatography of Pendimethalin under different percentages of mobile phase

表1 色譜柱溫對二甲戊靈的影響Table 1 Effects of different temperatures of chromatogram columnon Pendimethalin

2.4 標準曲線

將不同濃度的二甲戊靈標準溶液，在流動相V甲醇︰V水= 85︰15 、流速1 mL/min、檢測波長238 nm、柱溫30℃、進樣量20 μL的檢測條件下進行測定，以二甲戊靈進樣濃度與相對應的色譜峰面積作標準曲線（圖4）。結果表明，二甲戊靈的濃度與峰面積呈現良好的線性關系，線性回歸方程為：Y = 111 826 x＋990.32，相關系數為0.999 8。這說明該檢測條件可以滿足0～2.500 mg/L范圍內二甲戊靈的檢測。在此條件下，二甲戊靈的檢測圖譜清晰、分離度較好、峰形完整（圖5）。

圖4 二甲戊靈的標準曲線Fig.4 Standard curve of Pendimethalin

圖5 二甲戊靈標樣的色譜圖Fig.5 Chromatogram of standard Pendimethalin sample

2.5 方法精密度

在最佳檢測條下，對添加了0.5 mg/L二甲戊靈標準溶液的稻米樣品連續測定5次，其峰面積分別為60 988、61 293、60 553、61 078和61 573 mAU·s，變異系數為0.619%。這表明該方法精密度較好，儀器的穩定性和重現性較高。

2.6 添加回收率測定

從表2中看出，當二甲戊靈在稻米中添加濃度為0.1、0.2、2.0 mg/kg 時，添加回收率為87.40%～ 94.16%，變異系數為3.38%～6.70%，儀器最小檢出限為9.14×10-12g，方法最低檢出濃度為0.005 mg/kg，符合農藥殘留量分析方法的技術要求[4]。

表2 二甲戊靈在稻米中添加的回收率Table 2 Recoveries of Pendimethalin in rice

3 結論與討論

使用HPLC檢測稻米中二甲戊靈的方法有靈敏度高、穩定性好等優點。試驗結果表明，最佳檢測條件為：檢測波長238 nm，流動相比例V甲醇︰V水= 85︰15，柱溫30℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。在該檢測條件下，對稻米添加標準樣品的回收率為87.40%～94.16%，變異系數為3.38%～6.70%，儀器最小檢出限為9.14×10-12g，方法最低檢出濃度為0.005 mg/kg，符合農藥殘留檢測要求。這表明該方法可用于稻米中的二甲戊靈殘留檢測。

在提取和凈化稻米樣品中的二甲戊靈時，采取了過層析柱的措施，大大降低了稻米中雜質對提取結果的影響。該措施充分利用了二甲戊靈的水溶性較低、易被有機溶劑萃取的特性，同時對抽濾過程中進入濾液的米粒起到了過濾作用，對其他雜質也有較好的分離效果，大大提高了檢測樣品中的二甲戊靈純度，有效避免了雜質的干擾。

[1]張 宇.二甲戊靈在馬鈴薯和土壤中的殘留及吸附研究[D].吉林：吉林農業大學碩士學位論文，2005.

[2]王振榮，李布青.農業商品大全[M].北京：中國商業出版社，1996.543-651.

[3]高 明，萬建兵.45%二甲戊靈微膠囊劑防除冬小麥田雜草試驗[J].現代農藥，2011，10（3）：55-56.

[4]農業部農藥檢定所.農藥殘留量實用檢測方法手冊第3卷[M].北京：中國農業出版社，2005.528-530.

[5]王 軍，朱魯生，林愛軍，等.二甲戊靈的殘留毒理研究現狀[J].農藥，2001，40（6）：8-11.

[6]Shobha S.Dissipation of Pendimethalin in Soil and Its Residues in Chickpea （Cicer arietinum L.） Under Field Conditions [J].Bull Environ Contam Toxicol，2012，89：1032-1036.

[7]楊 挺，朱 勇，趙 健，等.豆類蔬菜中二甲戊樂靈殘留檢測方法研究[J].食品科技，2006，（10）：246-248.

[8]潘康標，黃 彧，徐煒楓，等.青菜中二甲戊靈的殘留分析方法[J].南京曉莊學院學報，2010，6（13）：47-49.

[9]張麗芬.二甲戊樂靈在大蒜中殘留分析方法的研究[J].四川教育學院學報，2005，（7）：91-92.

[10]陳其勇，鄭文杰，肖亞兵，等.果蔬中二甲戊樂靈、氟樂靈、雙丁樂靈殘留測定[J].食品研究與開發，2011，32（9）：155-158.

[11]劉自友，郭洪偉，肖圣乾，等.30%二甲戊靈·撲草凈懸浮劑防除棉花田雜草試驗[J].安徽農學通報，2010，16（13）：141-142.

[12]張學文，劉亦學，張麗華，等.50%乙草胺微乳劑防除大豆田雜草及其安全性[J].農藥，2006，（5）：342-343.

[13]胡春明.3 30 g/L二甲戊靈EC防除水稻旱育秧田雜草試驗[J].安徽農學通報，2011，17（9）：144-145.

[14]許秀杰，張相權.18%二甲戊靈·異惡草松可濕性粉劑防除移栽稻田雜草藥效試驗研究[J].現代農藥，2007，6（3）：45-47.

[15]孫福生，董 杰.基質固相分散—反相液相色譜法測定蔬菜中二甲戊靈樂農藥殘留[J].分析試驗室，2010，（2）：69-72.

[16]Danion M，Le F S，Castric J，et al.Effect of chronic exposure to pendimethalin on the susceptibility of rainbow trout，Oncorhynchus mykiss L.，to viral hemorrhagic septicemia virus （VHSV）[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，79：28-34.

[17]Unde?er U，Schlumpf M，Lichtensteiger W.Effect of the herbicide pendimethalin on rat uterine weight and gene expression and in silico receptor binding analysis [J].Food and Chemical Toxicology，2010，48（2）：502-508.

[18]宋 鈺，孫泰威.18%二甲戊靈·異惡草松可濕性粉劑的高效液相色譜分析[J].化學工程師，2009，165（6）：56-57.

[19]李永新，李 倩，潘紅梅，等.高效液相色譜法測定水中二甲戊樂靈[J].現代預防醫學，2006，33（5）：786-789.

[20]吳兵兵，胡 敏，張 強，等.二甲戊靈的GC和HPLC分析方法研究[J].化工中間體，2008，（7）：7-9.

[21]張 強，胡 敏，李二虎，等.毛細管氣相色譜法定量分析二甲戊靈[J].現代農藥，2007，6（1）：27-28.

[22]李 闖，侯志廣，劉建國，等.氣相色譜法測定大蒜中二甲戊樂靈·乙氧氟草醚·乙草胺3種除草劑的殘留[J].安徽農業科學，2011，39（22）：13429-13430，13433.