花生葉片DNA快速提取方法的優化

王蕾　趙新濤　許夢琦等

摘要：以花生幼葉為試材，對高通量DNA提取法、SDS簡易法、TPS法以及TENP法4種不同的DNA提取方法進行比較和優化。結果表明，與其他3種改良方法比較，改良TPS法具有不需液氮磨樣、提取速度快、試劑種類少、成本低、DNA溶解速度快、質量較好的優點，提取的DNA可用于花生SSR分析。

關鍵詞：花生；基因組DNA；提取方法；幼葉

中圖分類號：S565.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）07-0011-04

AbstractWith the young leaves of peanut as experiment material， four different DNA extraction methods， the high-throughput DNA extraction method， the simple SDS method， TPS method and TENP method， were compared and optimized. The results showed that， compared with the other improved methods， the improved TPS method had the advantages of grinding samples with no liquid nitrogen， faster extraction rate， fewer kinds of reagent， lower cost， rapider DNA solution rate and better DNA quality. The DNA extracted through improved TPS method could be used for SSR analysis of peanut.

Key wordsPeanut （Arachis hypogaea L.）；Genomic DNA；Extraction method；Young leaves

DNA是遺傳信息的載體，DNA的提取是分子生物學研究的基礎。植物總DNA的提取方法主要有CTAB法[1]、高鹽低pH法[2，3]、SDS法[4]等。近年來，許多研究人員根據不同的植物和不同的試驗要求對傳統的DNA提取方法進行改進和創新，取得了較好的效果[5，6]，但這些方法存在步驟繁瑣、有機溶劑殘留導致污染以及對人體造成危害等缺點。

李慶云等[6]研究發現，從花生不同部位提取DNA時，葉片的DNA產率最高。本研究對花生、小麥、玉米等植物葉片的4種DNA提取方法[7～10]進行改進和創新，力求尋找一種DNA質量和純度相對較好、可用于SSR分析的快速簡便的花生DNA提取方法，用于花生的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建及分子標記輔助選擇等研究。

1材料與方法

1.1試驗材料

以花生品種“四粒紅”的葉片為材料，由山東省花生研究所提供。

1.2DNA提取方法

分別對高通量DNA提取法[7]、SDS簡易法[8]、TPS法[9]以及TENP法[10]四種簡便的DNA提取方法進行改良及優化，方法如下。

1.2.1改良高通量DNA提取法（1）取新鮮幼葉約0.05 g，剪為0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL的Buffer A（100 mmol/L NaOH，2%Tween-20），95℃水浴10 min。（3）12 000 r/min離心10 min，取上清加入等體積的Buffer B （100 mmol/L Tris-HCl， 2 mmol/L EDTA-Na2）混勻。（4）加入預冷的等體積無水乙醇，輕輕上下顛倒混勻，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，將DNA沉淀風干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃長期保存。

1.2.2改良SDS簡易法（1）取新鮮幼葉約0.05 g，剪為0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL DNA提取液，漩渦混勻5 s，95℃水浴10 min（提取液包含200 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，0.5% SDS）。（3）12 000 r/min 離心10 min，取上清，加入等體積預冷的無水乙醇，輕輕上下顛倒混勻，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，將DNA沉淀風干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃長期保存。

1.2.3改良TPS法（1）取新鮮幼葉約0.05 g，剪為0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL TPS緩沖液，漩渦混勻5 s，95℃水浴10 min （TPS緩沖液包含100 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA）。（3）12 000 r/min離心10 min，取上清液加入等體積預冷的無水乙醇，上下顛倒混勻，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，將DNA沉淀風干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃長期保存。

1.2.4改良TENP法（1）新鮮幼葉約0.05 g，剪為0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL DNA提取液，漩渦混勻5 s，95℃水浴10 min （提取液包含100 mmol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，50 mmol/L EDTA）。（3）12 000 r/min 離心10 min，取上清加入等體積預冷的無水乙醇，輕輕上下顛倒混勻，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，將DNA沉淀風干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃長期保存。

1.3DNA質量檢測

用紫外分光光度計（BiophotometerRS232C，Eppendorf AG）測OD值。如果A260/A280值在1.8～2.0，表明提取的DNA質量和純度較好，若比值小于1.8表示有蛋白質污染，大于2.0表明RNA含量較高。

DNA的電泳檢測使用0.8%瓊脂糖凝膠，上樣緩沖液上樣量為4 μL，120 V、電泳40 min。如果電泳后DNA譜帶較多或連片，表明DNA分子已破碎或已降解，這樣的DNA將無法用于PCR；反之，DNA為一條帶，且距點樣孔較近，則說明DNA完整。

1.4SSR分析及檢測

SSR反應體系包含模板2 μL，2×PCR Master Mix 5 μL（包含Buffer，Taq酶，dNTPs，購自北京天根生化科技有限公司），正反引物各0.3 μL，ddH2O 2.4 μL。SSR分析熱循環程序：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，5個循環，每個循環退火溫度遞減0.5℃；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR擴增產物進行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色[11]。

2結果與分析

2.1DNA提取方法的優化

本試驗對4種不同的DNA提取方法進行了改良。①將原始的TPS法以及TENP法對材料的液氮處理改為研磨棒研磨。②改良后的TENP法中未添加RNase A。③在原始的高通量DNA提取法中增加了離心和無水乙醇沉淀的步驟。④將原始的SDS簡易法、TENP法以及TPS法中加入DNA提取液后靜置1 h、65℃溫育40 min以及75℃水浴30 min處理均改為95℃水浴10 min。

改良之后大大縮短了整個試驗過程。最后提取的DNA沉淀如圖1所示，改良高通量DNA提取法最終得到半透明黃綠色膠狀DNA；改良SDS簡易法最終得到的DNA沉淀為含有大量葉綠素的綠色固體；改良TPS法最終得到半透明淡黃色膠狀DNA；改良TENP法最后沉淀DNA為淺褐色片狀固體。將DNA風干時發現，風干最快的是改良TPS法和改良TENP法提取的DNA，而改良高通量DNA提取法和改良SDS簡易法所提DNA風干較慢，大約需要10 h以上。在之后的TE溶解DNA過程中，發現改良高通量DNA提取法和改良TPS法得到的膠狀半透明DNA溶解最快，而改良SDS簡易法和改良TENP法得到的綠色固體和褐色片狀的DNA溶解慢，甚至有不溶的現象。

由于改良高通量法提取DNA含有部分葉綠素，風干速度慢，且A260/A280值小于1.8，存在蛋白質污染，瓊脂糖凝膠電泳檢測時無DNA條帶，故排除此法。改良SDS所提取的DNA含有較多葉綠素、不易溶解、存在RNA污染，瓊脂糖凝膠電泳存在DNA降解的問題，故也排除此法。改良TENP法提取的DNA較難溶解、A260/A280值大于2.0、瓊脂糖電泳檢測存在雜質污染的問題，故排除此法。改良TPS法提取的DNA溶解最快，A260/A280值接近2.0，瓊脂糖電泳檢測呈現一條譜帶，且通過SSR分析可以獲得理想的效果，故可作為一種較好的適用于SSR分析的花生葉片DNA快速提取方法。

3討論

許多研究表明，健康的幼葉是試驗的最佳樣本來源。本研究選取新鮮的花生嫩葉，其中DNA含量相對較多，纖維素含量較少，易于提取，避免了較老葉片中含有的多糖、多酚等代謝物質對PCR反應的抑制作用。本研究對高通量DNA提取法、SDS簡易法、TPS法以及TENP法4種不同的應用于其它植物的DNA提取方法進行改良，通過對DNA進行質量檢測與SSR擴增驗證，最終篩選出的最佳花生葉片提取方法為改良TPS法。其所提取的DNA具有良好的完整性，質量達到SSR分析的要求，可用于花生SSR分子標記分析。本方法具有以下優點：

（1）磨樣簡便。使用研磨棒直接在離心管中研磨，方便快捷，適用于少量DNA的提取，省去了對研缽清洗及再次滅菌的環節，避免了交叉污染，無需液氮，降低了成本。

（2）節約試劑。減少了β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、聚乙烯吡咯烷酮等的使用，避免了有機試劑對人體的危害，降低了試劑成本。

（3）用時短。避免反復抽提，省去了苯酚/氯仿和氯仿/異戊醇重復抽提的過程，僅通過提高提取液中的KCl濃度來沉淀蛋白質和阻止多酚等次生物質的氧化，達到去除蛋白質的目的[10]。同時升高水浴溫度，縮短水浴時間，大大加快了提取速度。

由于提取步驟的簡化，本提取方法也存在一些弊端。采用研磨棒磨樣，可能會造成研磨不夠徹底，有所浪費，且常溫下磨樣要快速進行。本方法得到的DNA對SSR標記分析沒有影響，但其質量能否滿足RFLP和AFLP等標記分析的需要，仍需進一步的試驗。

參考文獻：

[1]熊勁芳， 向育君， 張正奇. 花生總DNA的快速提取與純化研究[J].生物學雜志， 2003， 20（2）： 32-34.

[2]苗曉燕， 賈曉梅. 藥用植物虎杖毛狀根DNA提取方法研究[J]. 保定學院學報， 2009， 22（4）： 67-69.

[3]Guillernsut P， Drouard L M. Isolation of plant DNA： A fast， inexpensive， and reliable method [J]. Plant Mol. Bio. Rep.， 1992， 10（1）： 60-65.

[4]詹潔， 余永昌， 何龍飛， 等. 一種優化的提取花生根尖細胞DNA的方法[J]. 花生學報， 2006， 35（3）： 10-13.

[5]謝皓， 陳學珍， 馮永慶， 等. 一種適于SSR-PCR的大豆葉片微量DNA簡便提取方法[J]. 北京農學院學報， 2007， 22（1）： 62-64.

[6]陳靜， 胡曉輝， 苗華榮， 等. CTAB法提取花生總DNA在SSR和SRAP中的擴增效果[J]. 花生學報， 2008， 37（1）： 29-31.

[7]Chu Y， Wu C L， Holbrook C C， et al. Marker-assisted selection to pyramid nematode resistance and the high oleic trait in peanut [J]. The Plant Genome， 2011， 4 （2）：110-117.

[8]Edwards K， Johnstone C， Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis [J]. Nucleic Acids Research， 1991， 19（6）： 1349.

[9]穆春華， 張發軍， 李文才， 等. 玉米葉片基因組快速提取方法研究[J]. 玉米科學， 2010， 18（3）： 170-172.

[10]師麗紅， 楊文香， 劉大群. 小麥基因組的一種簡易提取方法[J]. 中國農學通報， 2010， 26（19）： 22-26.

[11]梁宏偉， 王長忠， 李忠， 等. 聚丙烯酰胺凝膠快速高效銀染方法的建立[J]. 遺傳， 2008， 30（10）： 1379-1382.山 東 農 業 科 學2014，46（7）：15～19Shandong Agricultural Sciences

1.3DNA質量檢測

用紫外分光光度計（BiophotometerRS232C，Eppendorf AG）測OD值。如果A260/A280值在1.8～2.0，表明提取的DNA質量和純度較好，若比值小于1.8表示有蛋白質污染，大于2.0表明RNA含量較高。

DNA的電泳檢測使用0.8%瓊脂糖凝膠，上樣緩沖液上樣量為4 μL，120 V、電泳40 min。如果電泳后DNA譜帶較多或連片，表明DNA分子已破碎或已降解，這樣的DNA將無法用于PCR；反之，DNA為一條帶，且距點樣孔較近，則說明DNA完整。

1.4SSR分析及檢測

SSR反應體系包含模板2 μL，2×PCR Master Mix 5 μL（包含Buffer，Taq酶，dNTPs，購自北京天根生化科技有限公司），正反引物各0.3 μL，ddH2O 2.4 μL。SSR分析熱循環程序：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，5個循環，每個循環退火溫度遞減0.5℃；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR擴增產物進行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色[11]。

2結果與分析

2.1DNA提取方法的優化

本試驗對4種不同的DNA提取方法進行了改良。①將原始的TPS法以及TENP法對材料的液氮處理改為研磨棒研磨。②改良后的TENP法中未添加RNase A。③在原始的高通量DNA提取法中增加了離心和無水乙醇沉淀的步驟。④將原始的SDS簡易法、TENP法以及TPS法中加入DNA提取液后靜置1 h、65℃溫育40 min以及75℃水浴30 min處理均改為95℃水浴10 min。

改良之后大大縮短了整個試驗過程。最后提取的DNA沉淀如圖1所示，改良高通量DNA提取法最終得到半透明黃綠色膠狀DNA；改良SDS簡易法最終得到的DNA沉淀為含有大量葉綠素的綠色固體；改良TPS法最終得到半透明淡黃色膠狀DNA；改良TENP法最后沉淀DNA為淺褐色片狀固體。將DNA風干時發現，風干最快的是改良TPS法和改良TENP法提取的DNA，而改良高通量DNA提取法和改良SDS簡易法所提DNA風干較慢，大約需要10 h以上。在之后的TE溶解DNA過程中，發現改良高通量DNA提取法和改良TPS法得到的膠狀半透明DNA溶解最快，而改良SDS簡易法和改良TENP法得到的綠色固體和褐色片狀的DNA溶解慢，甚至有不溶的現象。

由于改良高通量法提取DNA含有部分葉綠素，風干速度慢，且A260/A280值小于1.8，存在蛋白質污染，瓊脂糖凝膠電泳檢測時無DNA條帶，故排除此法。改良SDS所提取的DNA含有較多葉綠素、不易溶解、存在RNA污染，瓊脂糖凝膠電泳存在DNA降解的問題，故也排除此法。改良TENP法提取的DNA較難溶解、A260/A280值大于2.0、瓊脂糖電泳檢測存在雜質污染的問題，故排除此法。改良TPS法提取的DNA溶解最快，A260/A280值接近2.0，瓊脂糖電泳檢測呈現一條譜帶，且通過SSR分析可以獲得理想的效果，故可作為一種較好的適用于SSR分析的花生葉片DNA快速提取方法。

3討論

許多研究表明，健康的幼葉是試驗的最佳樣本來源。本研究選取新鮮的花生嫩葉，其中DNA含量相對較多，纖維素含量較少，易于提取，避免了較老葉片中含有的多糖、多酚等代謝物質對PCR反應的抑制作用。本研究對高通量DNA提取法、SDS簡易法、TPS法以及TENP法4種不同的應用于其它植物的DNA提取方法進行改良，通過對DNA進行質量檢測與SSR擴增驗證，最終篩選出的最佳花生葉片提取方法為改良TPS法。其所提取的DNA具有良好的完整性，質量達到SSR分析的要求，可用于花生SSR分子標記分析。本方法具有以下優點：

（1）磨樣簡便。使用研磨棒直接在離心管中研磨，方便快捷，適用于少量DNA的提取，省去了對研缽清洗及再次滅菌的環節，避免了交叉污染，無需液氮，降低了成本。

（2）節約試劑。減少了β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、聚乙烯吡咯烷酮等的使用，避免了有機試劑對人體的危害，降低了試劑成本。

（3）用時短。避免反復抽提，省去了苯酚/氯仿和氯仿/異戊醇重復抽提的過程，僅通過提高提取液中的KCl濃度來沉淀蛋白質和阻止多酚等次生物質的氧化，達到去除蛋白質的目的[10]。同時升高水浴溫度，縮短水浴時間，大大加快了提取速度。

由于提取步驟的簡化，本提取方法也存在一些弊端。采用研磨棒磨樣，可能會造成研磨不夠徹底，有所浪費，且常溫下磨樣要快速進行。本方法得到的DNA對SSR標記分析沒有影響，但其質量能否滿足RFLP和AFLP等標記分析的需要，仍需進一步的試驗。

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[7]Chu Y， Wu C L， Holbrook C C， et al. Marker-assisted selection to pyramid nematode resistance and the high oleic trait in peanut [J]. The Plant Genome， 2011， 4 （2）：110-117.

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[9]穆春華， 張發軍， 李文才， 等. 玉米葉片基因組快速提取方法研究[J]. 玉米科學， 2010， 18（3）： 170-172.

[10]師麗紅， 楊文香， 劉大群. 小麥基因組的一種簡易提取方法[J]. 中國農學通報， 2010， 26（19）： 22-26.

[11]梁宏偉， 王長忠， 李忠， 等. 聚丙烯酰胺凝膠快速高效銀染方法的建立[J]. 遺傳， 2008， 30（10）： 1379-1382.山 東 農 業 科 學2014，46（7）：15～19Shandong Agricultural Sciences

1.3DNA質量檢測

用紫外分光光度計（BiophotometerRS232C，Eppendorf AG）測OD值。如果A260/A280值在1.8～2.0，表明提取的DNA質量和純度較好，若比值小于1.8表示有蛋白質污染，大于2.0表明RNA含量較高。

DNA的電泳檢測使用0.8%瓊脂糖凝膠，上樣緩沖液上樣量為4 μL，120 V、電泳40 min。如果電泳后DNA譜帶較多或連片，表明DNA分子已破碎或已降解，這樣的DNA將無法用于PCR；反之，DNA為一條帶，且距點樣孔較近，則說明DNA完整。

1.4SSR分析及檢測

SSR反應體系包含模板2 μL，2×PCR Master Mix 5 μL（包含Buffer，Taq酶，dNTPs，購自北京天根生化科技有限公司），正反引物各0.3 μL，ddH2O 2.4 μL。SSR分析熱循環程序：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，5個循環，每個循環退火溫度遞減0.5℃；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR擴增產物進行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色[11]。

2結果與分析

2.1DNA提取方法的優化

本試驗對4種不同的DNA提取方法進行了改良。①將原始的TPS法以及TENP法對材料的液氮處理改為研磨棒研磨。②改良后的TENP法中未添加RNase A。③在原始的高通量DNA提取法中增加了離心和無水乙醇沉淀的步驟。④將原始的SDS簡易法、TENP法以及TPS法中加入DNA提取液后靜置1 h、65℃溫育40 min以及75℃水浴30 min處理均改為95℃水浴10 min。

改良之后大大縮短了整個試驗過程。最后提取的DNA沉淀如圖1所示，改良高通量DNA提取法最終得到半透明黃綠色膠狀DNA；改良SDS簡易法最終得到的DNA沉淀為含有大量葉綠素的綠色固體；改良TPS法最終得到半透明淡黃色膠狀DNA；改良TENP法最后沉淀DNA為淺褐色片狀固體。將DNA風干時發現，風干最快的是改良TPS法和改良TENP法提取的DNA，而改良高通量DNA提取法和改良SDS簡易法所提DNA風干較慢，大約需要10 h以上。在之后的TE溶解DNA過程中，發現改良高通量DNA提取法和改良TPS法得到的膠狀半透明DNA溶解最快，而改良SDS簡易法和改良TENP法得到的綠色固體和褐色片狀的DNA溶解慢，甚至有不溶的現象。

由于改良高通量法提取DNA含有部分葉綠素，風干速度慢，且A260/A280值小于1.8，存在蛋白質污染，瓊脂糖凝膠電泳檢測時無DNA條帶，故排除此法。改良SDS所提取的DNA含有較多葉綠素、不易溶解、存在RNA污染，瓊脂糖凝膠電泳存在DNA降解的問題，故也排除此法。改良TENP法提取的DNA較難溶解、A260/A280值大于2.0、瓊脂糖電泳檢測存在雜質污染的問題，故排除此法。改良TPS法提取的DNA溶解最快，A260/A280值接近2.0，瓊脂糖電泳檢測呈現一條譜帶，且通過SSR分析可以獲得理想的效果，故可作為一種較好的適用于SSR分析的花生葉片DNA快速提取方法。

3討論

許多研究表明，健康的幼葉是試驗的最佳樣本來源。本研究選取新鮮的花生嫩葉，其中DNA含量相對較多，纖維素含量較少，易于提取，避免了較老葉片中含有的多糖、多酚等代謝物質對PCR反應的抑制作用。本研究對高通量DNA提取法、SDS簡易法、TPS法以及TENP法4種不同的應用于其它植物的DNA提取方法進行改良，通過對DNA進行質量檢測與SSR擴增驗證，最終篩選出的最佳花生葉片提取方法為改良TPS法。其所提取的DNA具有良好的完整性，質量達到SSR分析的要求，可用于花生SSR分子標記分析。本方法具有以下優點：

（1）磨樣簡便。使用研磨棒直接在離心管中研磨，方便快捷，適用于少量DNA的提取，省去了對研缽清洗及再次滅菌的環節，避免了交叉污染，無需液氮，降低了成本。

（2）節約試劑。減少了β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、聚乙烯吡咯烷酮等的使用，避免了有機試劑對人體的危害，降低了試劑成本。

（3）用時短。避免反復抽提，省去了苯酚/氯仿和氯仿/異戊醇重復抽提的過程，僅通過提高提取液中的KCl濃度來沉淀蛋白質和阻止多酚等次生物質的氧化，達到去除蛋白質的目的[10]。同時升高水浴溫度，縮短水浴時間，大大加快了提取速度。

由于提取步驟的簡化，本提取方法也存在一些弊端。采用研磨棒磨樣，可能會造成研磨不夠徹底，有所浪費，且常溫下磨樣要快速進行。本方法得到的DNA對SSR標記分析沒有影響，但其質量能否滿足RFLP和AFLP等標記分析的需要，仍需進一步的試驗。

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[9]穆春華， 張發軍， 李文才， 等. 玉米葉片基因組快速提取方法研究[J]. 玉米科學， 2010， 18（3）： 170-172.

[10]師麗紅， 楊文香， 劉大群. 小麥基因組的一種簡易提取方法[J]. 中國農學通報， 2010， 26（19）： 22-26.

[11]梁宏偉， 王長忠， 李忠， 等. 聚丙烯酰胺凝膠快速高效銀染方法的建立[J]. 遺傳， 2008， 30（10）： 1379-1382.山 東 農 業 科 學2014，46（7）：15～19Shandong Agricultural Sciences