響應面法優化超聲輔助提取紅皮云杉多酚工藝

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(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040； 2.黑龍江省質量監督檢測研究院,黑龍江哈爾濱 150020； 3.哈爾濱工業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150090)

響應面法優化超聲輔助提取紅皮云杉多酚工藝

周芳1,2,趙鑫1,宮婕1,劉海鵬1,王振宇1,3，*

(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040； 2.黑龍江省質量監督檢測研究院,黑龍江哈爾濱 150020； 3.哈爾濱工業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150090)

采用響應面法優化超聲波輔助提取紅皮云杉多酚工藝。在單因素實驗的基礎上,選擇料液比、超聲波功率、提取時間為自變量,以多酚得率為響應值,采用Box-Benhnken法設計三因素三水平的響應分析實驗。結果表明,回歸模型擬合度高,最佳工藝條件為：料液比1∶33、超聲波功率301W、提取時間2.4h,乙醇濃度40%,溫度60℃。在此條件下,紅皮云杉多酚的得率為18.92%。

紅皮云杉,多酚,超聲波,響應面

紅皮云杉(PiceakoraiensisNakai)是松科云杉屬常綠喬木,分布于大、小興安嶺、完達山及張廣才嶺,吉林長白山等地。松科植物中含有萜類、多酚類、生物堿等多種生物活性成分[l],具有抗氧化、抗病毒及抗菌等生物活性[2-3]。植物多酚,習慣稱單寧或鞣質,廣泛存在于植物體的葉、木、皮、殼和果肉中,許多針葉樹皮中植物多酚含量高達20%～40%[4]。植物多酚作為一類儲存豐富可再生的綠色資源,可作為高附加值的精細化工原料,隨著許多新用途的發現,尤其是許多新型的醫藥,農藥以此為原料,因此國內外需求量逐年上升,目前已成為國內熱點的精細化工原料[5]。超聲波可產生機械破碎和空化作用,使細胞破碎,加速浸提物從原料向溶劑的擴散,與傳統浸提法相比,具有提取效率高、溫度低、能耗低、提取時間短等特點[6-7]。本文采用響應面法優化超聲波輔助提取紅皮云杉多酚的工藝,旨在為紅皮云杉的深入研究和工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

紅皮云杉球果 采自長白山；無水乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯 天津市富宇精細化工有限公司,無水碳酸鈉 天津市恒興化學試劑制造有限公司；沒食子酸 SIGMA公司；福林酚試劑 天津市東麗區天大化學試劑；所用化學試劑均為分析純。

高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器公司；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用公司；KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；NDJ-1電熱恒溫水浴鍋 北京醫療電子儀器廠；電子天平 上海精天電子儀器廠；TDL-5臺式離心機 上海科興儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 多酚提取工藝過程 紅皮云杉球果→干燥→粉碎(40目)→除脂→干燥→超聲輔助提取→離心→取上清液→定容并測量吸光度→計算多酚得率

1.2.2 標準曲線的繪制 分別準確量取沒食子酸標樣(材料中沒有列出)溶液(100μg/mL)0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL于10mL比色管中,加蒸餾水至2mL,搖勻后加入1.0mL福林酚(材料中沒有列出)試劑,4min后加入1.0mL 10%的碳酸鈉溶液,25℃水浴下保持2h后,在765nm處測定吸光度值,得標準曲線回歸方程為：y=0.0214x+0.0033,R2=0.9992。

1.2.3 紅皮云杉多酚得率的測定 準確吸取1mL紅皮云杉球果提取液于10mL比色管中,加蒸餾水至總體積為2mL。加入1.0mL福林酚試劑后搖勻,4min后加入1.0mL 10%碳酸鈉溶液,25℃水浴下保持2h后,在765nm處測定吸光度值。將吸光度值代入標準曲線方程,計算樣品中多酚的得率。

式中：Y-多酚得率(%),A-吸光值,b-標準曲線截距,N-稀釋倍數,V-溶劑體積(mL),a-標準曲線斜率,M-紅皮云杉球果粉末質量(g)。

1.2.4 單因素實驗 通過單因素實驗,分別考察料液比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度、超聲波功率對紅皮云杉多酚得率的影響。

1.2.4.1 料液比對多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在乙醇濃度為40%、超聲波功率為250W、提取溫度為50℃、提取時間為2h的條件下,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。

1.2.4.2 乙醇濃度對多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在料液比為1∶20、超聲波功率為250W、提取溫度為50℃、提取時間為2h的條件下,乙醇濃度分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%。

1.2.4.3 提取時間對多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、超聲波功率為250W、提取溫度為50℃的條件下,提取時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h。

1.2.4.4 提取溫度對多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、超聲波功率為250W、提取時間為2h的條件下,提取溫度分別為30、40、50、60、70、80℃。

1.2.4.5 超聲波功率對多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、提取溫度為50℃、提取時間為2h的條件下,超聲波功率分別為200、250、300、350、400、450W。

1.2.5 響應面法實驗設計 在單因素實驗的基礎上,以料液比、超聲功率、超聲時間三個因素為自變量,以多酚得率為響應值,采用Box-Behnken設計法優化多酚提取工藝條件,分析軟件為Statistica 6.0。設計三因素三水平響應分析實驗,中心點實驗重復5次,實驗的因素水平編碼見表1。

表1 響應面分析因素和水平表

2 結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1 料液比對多酚得率的影響 由圖1可知,在料液比在1∶10～1∶30時,隨料液比的增加,多酚得率也增加,且基本呈正相關關系,在料液比為1∶30時,多酚得率最高；在料液比為1∶30～1∶60時,隨料液比的增加,多酚得率有所下降。由增加濃度梯度可增加提取效果[8],因而提高料液比有利于多酚的提取,但當料液比達到某一限度時,再提高料液比則相當于對多酚溶液的稀釋,降低了濃度梯度,同時,更多的溶劑也可能消耗了超聲波的能量,所以多酚得率反而有所下降。因此,選擇料液比為1∶30左右進行后續優化實驗。

圖1 料液比對多酚得率的影響

2.1.2 乙醇濃度對多酚得率的影響 乙醇具有浸提選擇性好、對植物細胞的穿透能力強、浸出率高、提取時間短、溶解出的雜質少、提取物不易霉變、且毒性小等優點[9]。由圖2可知,在乙醇濃度為0～40%時,隨著乙醇濃度的增加,多酚得率隨之增加,且基本呈正相關關系,乙醇濃度為40%,多酚得率最高；繼續增加乙醇濃度,多酚得率明顯下降,這可能是因為乙醇濃度為40%時,與紅皮云杉多酚的極性最為相近,多酚的溶解度最大。因此,最終選擇乙醇濃度為40%。

2.1.3 提取時間對多酚得率的影響 由圖3可知,在提取時間為0.5～1h時,隨著提取時間的增加,多酚得率明顯增加,且基本呈正相關關系；在提取時間為1～2h時,多酚得率增加較緩,在2h時,多酚得率已達到較高水平；在提取時間為2～3h時,多酚得率增加不明顯,多酚的提取量已經達到飽和。因此,選擇提取時間為2h左右進行后續優化實驗。

圖2 乙醇濃度對多酚得率的影響

圖3 提取時間對多酚得率的影響

2.1.4 提取溫度對多酚得率的影響 由圖4可知,在提取溫度為30～60℃時,隨著提取溫度的增加,多酚得率明顯增加,且基本呈正相關關系,提取溫度為60℃,多酚得率最高；在提取溫度為60～80℃時,多酚得率有所下降。多酚中含有大量的酚羥基,化學性質比較活潑,在一定的溫度范圍內,提高溫度有利于多酚的提取,但是在較高的溫度下,多酚會變得很不穩定。Antolovich[10]的研究也發現,當溫度達到60℃后,多酚的提取量顯著下降。因此,最終選擇提取溫度為60℃。

圖4 提取溫度對多酚得率的影響

2.1.5 超聲波功率對多酚得率的影響 由圖5可知,在超聲波功率為200～300W時,隨著超聲波功率的增加,多酚得率明顯增加,且基本呈正相關關系,在超聲波功率為300W時,多酚得率最高；在超聲波功率為300～450W時,多酚得率明顯下降,且基本呈負相關關系。隨著超聲波功率的增加,在單位時間內所產生的空化作用增多,熱效應增大,出現更為明顯的湍動效應和局部微攪動效應,有利于多酚的提取,但是在功率超過300W后,過高的聲強使溶液溫度升高過快,多酚有所損失,反而不利于多酚的提取。因此,選擇超聲波功率為300W左右進行后續優化實驗。

圖5 超聲波功率對多酚得率的影響

2.2響應面法優化提取工藝條件

2.2.1 響應面實驗設計及結果 根據Box-Behnken實驗設計原理,在單因素實驗的基礎上,選擇料液比、超聲波功率、提取時間3個因素,進行三因素三水平的響應面實驗設計,共17個實驗點,實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果

2.2.2 數學模型的建立及顯著性檢驗 對所得數據進行多元回歸擬合,方差分析結果見表3,得到的回歸模型為：

Y=18.744+0.675X1-0.095X2+0.575X3-0.025X1X2-0.045X1X3+0.09X2X3-1.182X12-0.477X22-0.317X32

由表3可知,回歸模型的顯著性水平p<0.0001,達到極顯著水平；失擬項p=0.556>0.05,影響不顯著,且相關系數R2=0.9954,表明實測值與預測值高度相關。綜上所述,建立的回歸模型擬合度高,可用該模型較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。因此,可用該模型預測紅皮云杉多酚的提取工藝條件。

表3 回歸模型方差分析

注：*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

回歸模型顯著性檢驗結果見表4。t檢驗結果表明,料液比、提取時間的一次項和二次項、超聲波功率的二次項對多酚得率的影響極顯著,超聲波功率的一次項對多酚得率的影響顯著,而交互項對多酚得率的影響不顯著。各因素對多酚得率影響程度大小順序為：料液比>提取時間>超聲波功率。

表4 回歸模型顯著性檢驗

注：*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

2.2.3 響應面優化與驗證實驗 利用Statistica 6.0軟件,繪制各因素對紅皮云杉多酚得率影響的響應曲面圖,結果見圖6～圖8。如果一個響應曲面的坡度較平緩,表明隨著處理條件的變化,響應值變化較小；而如果一個響應曲面的坡度較陡峭,表明隨著處理條件的變化,響應值變化較大。

由圖6可知,響應面的坡度較陡,表明料液比與超聲波功率的交互作用對多酚得率有較大影響,從等高線的疏密度可以判斷出,料液比對響應值的影響大于超聲波功率。

圖6 料液比和超聲波功率對多酚得率影響的響應面圖

圖7 料液比和提取時間對多酚得率影響的響應面圖

圖8 超聲波功率和提取時間對多酚得率影響的響應面圖

由圖7可知,響應面的坡度也較陡,表明料液比與提取時間的交互作用對多酚得率有較大影響,從等高線的疏密度可以判斷出,料液比對響應值的影響大于提取時間。

由圖8可知,響應面的坡度較平緩,表明超聲波功率與提取時間的交互作用對多酚得率的影響較小,從等高線的疏密度可以判斷出,提取時間對響應值的影響大于超聲波功率。

綜上所述,料液比對多酚得率的影響最大,提取時間次之,超聲波功率的影響較小。通過計算,得到的最佳工藝條件為：料液比為1∶32.69、超聲波功率為301.16W、提取時間為2.44h。在此條件下,紅皮云杉多酚的得率為19.09%。考慮到實際操作條件,將條件修正為料液比1∶33、超聲波功率301W、提取時間2.4h。在此條件下,進行驗證實驗,實際測得的得率為18.92%,實測值與預測值相對誤差<1%,說明回歸模型擬合度高,可用于優化紅皮云杉多酚的提取工藝條件,具有實用價值。

3 結論

本實驗在單因素實驗的基礎上,采用響應面分析法對紅皮云杉多酚的提取工藝條件進行了優化。結果表明,料液比、超聲波功率、提取時間對紅皮云杉多酚得率均有顯著影響,最佳工藝條件為：料液比1∶33、超聲波功率301W、提取時間2.4h,乙醇濃度40%,溫度60℃。驗證實驗結果表明,紅皮云杉多酚的得率為18.92%,回歸模型擬合度高,可用于優化紅皮云杉多酚的提取工藝條件,具有實用價值。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenol fromPiceakoraiensisNakaiby response surface methodology

ZHOUFang1,2,ZHAOXin1,GONGJie1,LIUHai-peng1,WANGZhen-yu1,3，*

(1. School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China; 2. The Academy of Quality Inspection and Research in Hei Long Jiang Province,Harbin 150020,China； 3. School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

The ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenol fromPiceakoraiensiswere optimized by response surface methodology. Based on single factor test,a 3-factor,3-level Box-Behnken experimental was adopted,including dependent variables(ratio of material to liquid,ultrasonic wave power and extraction time)and independent variable(yield of polyphenols). The results showed that the regression model fit well with experimental data. The optimum conditions were ratio of material to liquid 1∶33,ultrasonic wave power 301W,extraction time 2.4h,ethanol concentration 40%,extraction temperature 60℃. Under these conditions,the yield of polyphenol was 18.92%.

PiceakoraiensisNaka;polyphenol;ultrasonic wave;response surface methodology

2013-06-17 *通訊聯系人

周芳 (1981-),女,博士,工程師,研究方向：植物資源開發及植物活性成分研究。

國家自然科學基金資助項目(31170510)。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0210-05