紫山藥低醇發酵飲料中乙醇含量的氣相色譜法測定

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(1.天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津 300134； 2.北京市農林科學院蔬菜研究中心,北京 100097； 3.北京市農林科學院農業綜合發展研究所,北京 100097)

紫山藥低醇發酵飲料中乙醇含量的氣相色譜法測定

張紅雨1,宋曙輝2,周家華3,劉建福1,周連第3,*

(1.天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津 300134； 2.北京市農林科學院蔬菜研究中心,北京 100097； 3.北京市農林科學院農業綜合發展研究所,北京 100097)

建立了紫山藥低醇發酵飲料中乙醇含量的氣相色譜檢測方法。HP-INNOWAX(30m×0.25mm×25μm)毛細管柱為樣品分析柱時,甲醇為樣品的稀釋劑；正丙醇可作為乙醇定量分析的內標物。甲醇、乙醇、正丙醇的出峰時間分別為2.909、3.110、3.846min,乙醇與正丙醇的分離度大于30。乙醇濃度在0.2～6.0mg/mL范圍時,內標法測定的乙醇濃度與乙醇的峰面積的相關系數為0.9996,紫山藥樣品中乙醇的最低檢出限為0.05mg/mL。該測定方法的乙醇回收率在94.4%～107.4%之間,重復性實驗的相對標準偏差(RSD)為4.23%,可滿足紫山藥低醇發酵飲料中乙醇含量的測定要求。

氣相色譜,紫山藥低醇飲料,乙醇

紫山藥(DioscoreaalataL.)是山藥中的一個特色品種,因其塊根紫色而得名。紫山藥塊根中含有大量的碳水化合物、蛋白質,還含有豐富的B族維生素、維生素C、粘蛋白、花青素、薯蕷皂等生理活性成分[1-4]。粘蛋白、花青素、薯蕷皂分別具有阻止血脂在血管壁的沉淀、抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化、提高體內雌雄激素水平升高等生理功能,因此,經常食用紫山藥可以降低心血管疾病發生的風險、延緩衰老、免疫調節、抗氧化等作用[5-6]。低醇發酵飲料是在保留果蔬汁原有營養的同時,運用生物發酵技術賦予其一定的發酵風味,并將乙醇的含量控制在較低水平的果蔬汁飲料[7-8]。紫山藥中的淀粉經過糖化、發酵可以轉化成酒精,發酵過程中產生濃郁的發酵香氣。作者通過控制酒精發酵程度生產了低醇、花青素、薯蕷皂等多種生物活性物質的功能性紫山藥飲料。快速、準確測定低醇發酵飲料中乙醇含量是實現低醇飲料可控發酵的關鍵。乙醇含量的測定方法較多,比重法常用于測定乙醇含量較高的樣品如酒等。AOAC推薦采用重鉻酸鉀氧化法測定乙醇的含量。最近,Jonathan R. Dion報道了超聲頻率分析方法測定飲料中乙醇的含量[9],但該法需要寬頻超能換聲器,應用受到限制。氣相色譜具有快速、準確、能測定樣品中的微量成分等特點,為此,本文研究了低醇發酵飲料中乙醇含量的氣相色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

紫山藥低醇發酵飲料 自制；乙醇 色譜純,CAS：64-17-5,西隴化工股份有限公司；甲醇 色譜純,CAS：67-56-1,北京化工廠；正丙醇 色譜純,CAS：71-23-8,天津市津科精細化工研究所。

Agilent 7890A氣相色譜儀、FID檢測器 美國AGILENT公司,Chemstation 化學工作站；7683B自動進樣器 美國AGILENT公司；AG-1602型空氣泵 北京科普生分析科技有限公司；HG-1803型高純氫氣發生器 北京科普生分析科技有限公司；HZ050R離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科貿工有限公司；FB-10T溶劑過濾瓶 杭州匯爾儀器設備有限公司；LP503電子天平 精確至0.001g,常熟市衡器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 樣品處理 將發酵后的樣品在6000r/min轉速下離心5min,得上清液,再將上清液抽真空過0.45μm微孔濾膜,置冰箱備用。取待測樣品10mL于50mL容量瓶中,甲醇定容,再將待測定液在3000r/min下離心10min后過0.45μm有機濾膜,備用。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：HP-INNOWAX毛細管柱(30m×0.25mm×25μm)；FID檢測器溫度220℃,氫氣流速為40mL/min,空氣流速400mL/min,尾吹(N2)流速30mL/min；進樣口溫度200℃,分流比為20∶1；柱流速為1mL/min；柱溫平衡時間0.5min,程序升溫60℃(保持1min),以10℃/min升至120℃(保持1min)；進樣量1μL。

1.2.3 標準溶液配制與曲線繪制 標準儲備液：準確稱取乙醇10g(精確至0.001g)于100mL容量瓶中,用甲醇定容,得到濃度為100mg/mL儲備液,置冰箱保存。外標法標準溶液配制：分別準確量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.0mL標準儲備液于50mL容量瓶中,用甲醇定容,得到一系列標準溶液0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.0、6.0mg/mL。內標儲備液：準確稱取正丙醇10g(精確至0.001g)于100mL容量瓶中,用甲醇定容,得到濃度為100mg/mL的內標儲備液,置冰箱保存。內標法標準溶液配制：與外標法取相同標準儲備液,再分別加內標儲備液0.5mL,用甲醇定容,得到相同的標準溶液,其中內標正丙醇的濃度為1mg/mL。將配制好的標準溶液置冰箱保存待用,按照上述色譜條件進行GC測定。

1.2.4 樣品分析 在相同的氣相色譜條件下,將標準溶液過0.45μm有機濾膜后進行測定。以保留時間定性,外標法和內標法兩種方法進行定量,并選取最佳的定量方法來定量樣品中乙醇的含量。

2 結果與分析

2.1稀釋劑的選擇

在樣品稀釋時,常用高純水作為稀釋劑。實驗采用HP-INNOWAX毛細管柱,如果水作為稀釋劑,由于水的膨脹系數很大,一般要求進樣量在0.5μL以下,且進樣口與FID的溫度達到200℃以上,否則會造成毛細管柱的固定液的流失,減少柱子的使用壽命。為此選用甲醇作為樣品的稀釋劑,可以避免對毛細管柱的危害,同時實驗發現甲醇與乙醇的分離度大于2,有很好的分離效果(見圖1)。

2.2內標物的選擇

在分析乙醇含量時,常用的內標物有甲醇、丙醇、丁醇以及乙酸正丁酯等。不同的樣品采用不同的內標物,本文采用正丙醇作為乙醇的內標物,主要是考慮到：樣品中不含有正丙醇；正丙醇結構與被測組分乙醇相似；不與乙醇發生化學反應；乙醇與正丙醇有很好的分離效果,實驗中多次測試(n=8),其分離度均大于30。如圖1、圖2所示。

圖1 未加內標物的樣品圖

圖2 加內標物的樣品圖

2.3定性分析

采用保留時間法定性,在上述的色譜條件下,進1μL樣品所得色譜圖,進樣后甲醇在2.909min時出峰,乙醇在3.110min時出峰,正丙醇在3.846min出峰,見圖3。

表1 精密度實驗

表2 重現性實驗

表3 回收率實驗

圖3 樣品色譜圖

2.4定量分析

按照上述的色譜條件測定乙醇的標準溶液,分別用外標法和內標法進行定量分析(見圖4和圖5)。乙醇濃度在0.2～6.0mg/mL范圍內,采用外標法定量可得到標準曲線的相關系數R2為0.9828；采用內標法定量可得到標準曲線的相關系數R2在0.999以上,為此樣品定量分析選用內標法。同時將紫山藥樣品經過前處理后測定,以3倍信噪比計算出儀器的檢出限為0.01mg/mL。因為樣品在檢測前被稀釋了5倍,所以紫山藥樣品中乙醇的最低檢出限為0.05mg/mL。

圖4 外標法標準曲線圖

圖5 內標法標準曲線圖

2.5方法學考察

2.5.1 精密度實驗 在確定的色譜條件下,將樣品過0.45μm有機濾膜并連續測定6次,進行精密度考察。結果顯示,精密度實驗的相對標準偏差(RSD)為0.278%,表明該方法具有很好的精密度。

2.5.2 重現性實驗 取同一批6份發酵后的樣品,進行樣品處理作重復性考察。結果顯示,重復性實驗的相對標準偏差(RSD)為4.23%,這表明此檢測方法有較好的重現性。

2.5.3 回收率實驗 準備已知濃度的飲料樣品,分別加入不同體積的乙醇標準儲備液,按照上面的GC方法做加樣回收率實驗,結果顯示該方法的回收率在94.4%～107.4%之間,表明氣相色譜法能較好的測定乙醇的含量。

3 結論

采用HP-INNOWAX毛細管柱,選擇甲醇作為樣品的稀釋劑,正丙醇為定量測定乙醇的內標物,三者之間有較好的分離度,從而確定了內標法的定量方法。內標法定量具有良好的線性關系,相關系數在0.999以上。同時得到樣品中乙醇的最低檢出限為0.05mg/mL,重現性和精密度的相對標準偏差均小于5%,回收率在94.4%～107.4%之間。本方法定性、定量準確,可靠,準確度和回收率較高,可用于低醇發酵飲料中乙醇含量的測定。

[1]Zhongxiang Fang,Dan Wu,Dong Yu,etal. Phenolic compounds in Chinese purple yam and changes during vacuum frying[J]. Food Chemistry,2011,(128):943-948.

[2]于東,林躍偉,陳桂星,等. 紫山藥營養成分分析研究[J]. 營養學報,2010,32(2)：190-192.

[3]周新勇,宋曙輝,羅暉,等. 反相高效液相色譜法測定紫山藥中薯蕷皂苷的含量[J]. 食品工業科技,2011,32(7):420-422.

[4]Liu Ying,Shi Shan-shan,Wang Cai-sheng. Determination of Nutrients and Diosgenin Contents Dioscorea batatas Decne.in zhejiang[J]. Medicinal Plant,2010,1(2):21-23.

[5]Jau-Tien Lin,Deng-Jye Yang. Determination of steroidal saponins in different organs of yam(Dioscorea pseudojaponica Yamamoto)[J]. Food Chemistry,2008(108):1068-1074.

[6]陳少青,蔣旭鋼,汪財生,等. 紫山藥多糖超聲波輔助提取工藝優化及抗氧化性能研究[J]. 江蘇農業科學,2009(5)：231-234.

[7]譚余良,楊幼慧. 無醇及低醇發酵果汁研究進展[J]. 中國釀造,2006(5):1-3.

[8]Branyik T,Silva D P,Baszczynski M,etal. A review of methods of low alcohol and alcohol-free beer production[J]. Journal of Food Engineering,2012(108):493-506.

[9]Jonathan R Dion,David H Burns. Simultaneous determination of alcohol and carbohydrate content in commercial beverages by ultrasound frequency analysis[J]. Talanta,2011(86):384-392.

Determination of alcohol in purple yam low-alcohol fermented beverage by gas chromatography

ZHANGHong-yu1,SONGShu-hui2,ZHOUJia-hua3,LIUJian-fu1,ZHOULian-di3,*

(1.Institute of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China; 2.Beijing Vegetable Research Center of BAAFS,Beijing 100097,China; 3. Institute of Agricultural Integrated Development of BAAFS,Beijing 100097,China)

A method for gas chromatography determinnation of alcohol content in purple yam low-alcohol femented beverages was reported in this paper. The samples were separated on HP-INNOWAX(30m×0.25mm×25μm)capillary column. Methanol was chosen as the diluent and the n-propanol was used as the standard substance. Results showed that the peak time of methanol,ethanol and n-propanol was 2.909,3.110 and 3.846min,respectively. And the degree of separation for ethanol and n-propanol was more than 30. The linear range was 0.2～6.0mg/mL with a correlation of 0.9996,and the detection limits were 0.05mg/mL for alcohol in purple yam. Recoveries varied from 94.4%～107.4%,and the relative standard deviation(RSD)of the repetitive experimental was 4.23%. This method developed could be used to detect alcohol content in purple yam low-aocohol femented beverages.

gas chromatography;purple yam low-alcohol beverages;alcohol

2013-05-20 *通訊聯系人

張紅雨(1989-),女,在讀碩士研究生,研究方向：發酵工程。

北京市農林科學院科技創新能力建設專項。

TS278

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：1002-0306(2014)01-0307-04