柴達木盆地不同生長期菊芋葉片綠原酸含量變化規律研究

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(中國科學院藏藥研究重點實驗室,中國科學院西北高原生物研究所,青海西寧 810008)

柴達木盆地不同生長期菊芋葉片綠原酸含量變化規律研究

岳會蘭,畢宏濤,于瑞濤,張本印,陶燕鐸*

(中國科學院藏藥研究重點實驗室,中國科學院西北高原生物研究所,青海西寧 810008)

本研究以柴達木盆地不同生長期菊芋葉片為研究材料,建立了菊芋葉片綠原酸HPLC快速定量檢測方法,并對柴達木盆地菊芋葉片綠原酸含量隨生長期變化規律進行研究。在選擇流動相時,本文對測定條件進行優化,獲得了較好的分離度,并進行了標準曲線的繪制。對不同采集時間菊芋葉片綠原酸含量測定結果表明,不同生長期菊芋葉片綠原酸含量差異顯著,最高月份含量可達到最低月份含量的2倍,8月1日至10月15日菊芋葉片綠原酸含量呈上升趨勢,至10月15日達到最高(葉片干重的0.83%),隨后逐漸降低。以上實驗數據表明,柴達木地區作為綠原酸提取原料的菊芋葉片采收期以10月15日左右為宜。

菊芋,綠原酸,含量,變化規律

菊芋(HelianthustuberosusL.),屬菊科向日葵屬多年生宿根草本植物,因其地上似菊,地下為芋而得名,俗名洋姜、鬼子姜等。原產自北美洲,于17世紀傳入歐洲,后傳入伊朗、中國和日本。全球的熱帶、溫帶、寒帶以及干旱、半干旱地區都有菊芋的分布[1]。近幾年,我國對能源植物的開發和利用極大地促進了菊芋的大面積種植及開發項目的啟動,需求量日趨增大,逐漸形成了很多較為規范化、規?；木沼蠓N植園區和深度開發項目,并形成了規模日趨擴大的較為完整的“菊芋塊莖種植加工產業”鏈。但在菊芋產業鏈中,菊芋地上部分的利用程度不高。綠原酸(Chlorogenic acid)類化合物廣泛存在于植物中,是植物體在有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的一種苯丙素類化合物,為多酚類化合物,是菊芋的重要生理活性成分[2-3],具有降壓、利膽、清除自由基、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等多種藥理學功能[4-5]。目前,醫藥產業中所需的綠原酸主要來源于金銀花和杜仲的葉片中[6-7],而菊芋葉片綠原酸的研究還處于起步階段[8-10]。因此,為了明確菊芋葉片綠原酸含量變化規律,更好的將其應用于醫藥領域,本研究將建立HPLC菊芋葉片綠原酸快速定量檢測方法,并對柴達木盆地菊芋葉片綠原酸含量隨生長期變化規律進行研究,以期為菊芋葉片中綠原酸的高效利用提供依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菊芋品種J1 由蘭州大學劉建全教授課題組提供；菊芋葉片采集于青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣西河灘村菊芋種植基地(海拔2830m；N36.386,E98.024),分別于2012年8月至11月期間每月1日和15日采集7份樣本(樣本編號：QHDL-1、QHDL-2、QHDL-3、QHDL-4、QHDL-5、QHDL-6和QHDL-7),洗凈后低溫烘干備用；綠原酸對照品 購于中國藥品生物制品檢測所；乙腈為色譜純 山東禹王；其它試劑均為分析純。

Agilent 1200高效液相色譜儀,紫外檢測器Agilent化學工作站 美國安捷倫公司;UPT-I-5超純水機 成都超純科技有限公司；AG204電子分析天平 梅特勒公司；烘箱 上海一恒科學儀器有限公司；WP800SL23-2微波實驗儀 南京匯研微波系統工程有限公司。

1.2色譜條件

色譜柱：Dikma SynerSi 4u Fusion-RP 80R 250×4.6mm 4 micron；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；檢測波長：327nm；流動相：0.2%磷酸∶乙腈=82∶18；進樣量10μL。

1.3對照品溶液制備

用精密稱取綠原酸對照品10mg,用60%乙醇溶解并定容于50mL容量瓶,搖勻,得到0.2mg/mL儲備液。再分別稀釋到0.1、0.08、0.06、0.04、0.02mg/mL和0.01mg/mL,用60%乙醇定容于25mL容量瓶搖勻待用。

1.4菊芋葉片綠原酸待測溶液制備

各樣品分別取菊芋葉片烘干、粉碎,過80目篩。精密稱取粉碎的菊芋葉片1g(3份),加入20mL 60%乙醇,微波回流提取2次,每次25min,合并濾液,定容至50mL。將提取液過0.45μm濾膜,作為樣品溶液。

2 結果與分析

2.1線性關系考察

精密吸取對照品溶液10μL注入高效液相色譜儀,測定其峰面積,見圖1。以峰面積積分值為縱坐標(Y),樣品重量(μg)為橫坐標(X),繪制標準曲線,結果表明綠原酸在0.1～1.0μg范圍內呈良好的線性關系。回歸方程為y=1503.3x+183.62,相關系數R2為0.9994。

圖1綠原酸對照品(A)和菊芋葉樣品(B)HPLC圖譜

2.2精密度實驗

精密吸取對照品溶液10μL注入高效液相色譜儀,重復進樣6次,測定其峰面積,RSD為0.291%,精密度良好,結果見表1。

表1 精密度實驗

2.3穩定性實驗

取上述對照品溶液,每隔4h進樣,每次進樣10μL,測定其峰面積,結果表明在24h內綠原酸基本穩定,結果見表2。

表2 穩定性實驗

2.4重復性實驗

精確稱取QHDL-6樣品6份,依1.5方法制備樣品溶液,每次進樣10μL,分別在相同條件下測定綠原酸的含量,結果見表3,QHDL-6樣品的平均含量為0.829%,RSD=0.366%,結果表明實驗重復性良好。

表3 重復性實驗

2.5加樣回收率實驗

在樣品中加入一定濃度的綠原酸對照品溶液,按“樣品測定溶液的制備”項下操作,在上述色譜條件下進行測定,分別計算加樣回收率,結果見表4,綠原酸的平均回收率為96.4%,RSD=0.871%。

表4 綠原酸回收率

2.6樣品含量的測定

分別稱取菊芋葉片粉末,按“1.5”的方法制備供試液,測定含量,結果見表5。

表5 菊芋葉片材料編號與采集日期及其綠原酸含量

注：表中p值表示該采集日期與前一日期含量比較的差異顯著性。

對樣品綠原酸含量的測定結果顯示,柴達木地區菊芋葉片綠原酸含量隨其生長期變化明顯。菊芋葉片綠原酸含量從8月1日干重的0.42%增長到10月15日的0.83%,隨后下降至11月1日的0.73%。而10月1日至11月1日期間,正是菊芋塊莖的關鍵膨大期,塊莖增重明顯,其中10月15日至11月1日期間,柴達木地區氣溫驟降,地上部分逐漸失水,至11月1日后,葉片完全失水變脆。地上部分綠原酸類化合物的合成可能與其塊莖的膨大有一定的關系。

3 結論

本研究在選擇流動相時,參照張海娟等[10]的測定條件,并進行了優化,降低了甲醇-水-磷酸體系中磷酸濃度。根據前期預實驗結果本實驗選擇0.2%的磷酸為流動相條件,不僅可以減少高濃度磷酸對柱填料的傷害,同時也能獲得較好的分離度。此外,采用峰面積積分值為縱坐標(Y),樣品重量(μg)為橫坐標(X)做標準曲線,避免進樣體積對含量測定的影響。

對不同采集時間菊芋葉片綠原酸含量測定結果表明,不同生長期菊芋葉片綠原酸含量差異顯著,8月1日至10月15日菊芋葉片綠原酸含量呈上升趨勢,至10月15日達到最高(葉片干重的0.83%),隨后逐漸降低。以上實驗數據說明,柴達木地區作為綠原酸提取原料的菊芋葉片采收時期以10月15日左右為宜。目前還沒有文獻報道過菊芋葉片中綠原酸隨時間變化規律的研究,尤其是青海產菊芋葉片中綠原酸的相關研究尚未見報道。本研究對青海產菊芋葉片中綠原酸的采收和高效利用提供了重要的理論指導。

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Research of the contents variation of chlorogenic acid in the leaves ofHelianthustuberosusL. during different growth stages in Chaidamu

YUEHui-lan,BIHong-tao,YURui-tao,ZHANGBen-yin,TAOYan-duo*

(Key Laboratory of Tibetan Medicine Research,Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences,Xining 810008,China)

In this study,the rapid HPLC quantitative detection method of chlorogenic acid,and the contents variation of chlorogenic acid in the leaves ofHelianthustuberosusL. during different growth stages in Chaidamu were studied. In the choice of the mobile phase,the determination conditions were optimized,and obtained a better resolution. In addition,the standard curveand was carried out. The results showed that the chlorogenic acid contents in the leaves ofHelianthustuberosusL. during different growth stages had significant differences. The chlorogenic acid contents in the leaves ofHelianthustuberosusL. during August 1st to October 15th had an upward trend,and the highest content was reached on October 15th. The above experimental data indicated that the harvest period ofHelianthustuberosusL. should be determined around the October 15th.

HelianthustuberosusL.;chlorogenic acid;content;variation

2013-07-15 *通訊聯系人

岳會蘭(1981-),女,博士,助理研究員,主要從事藥物化學及新藥研發。

青海省省科技廳“菊芋適宜性栽培技術研究”(2011-N-515)。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0283-03