食源性沙門氏菌第Ⅰ類整合子檢測及其耐藥基因盒分析

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(華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

食源性沙門氏菌第Ⅰ類整合子檢測及其耐藥基因盒分析

周蓉,李琳,蘇健裕*,李冰,徐振波

(華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640)

目的:了解食源性沙門氏菌的耐藥性、Ⅰ類整合子分布及其耐藥基因盒的結構序列,為Ⅰ類整合子的分子進化提供理論基礎。方法：采用K-B紙片法檢測食源性沙門氏菌對14種抗生素的敏感性；利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增整合酶基因intI1檢測食源性沙門氏菌中Ⅰ類整合子攜帶率及可變區耐藥基因盒。結果：食源性沙門氏菌對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類和磺胺類的最高耐藥率分別為18.75%、12.5%、6.25%和25%。59.4%(19/32)的食源性沙門氏菌檢測出第Ⅰ類整合子。PCR 擴增Ⅰ類整合子耐藥基因盒,擴增產物大小為1009和1664bp,攜帶aadA5、dfr17和aadA2耐藥基因,可分別介導對氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類藥物甲氧芐氨嘧啶的耐藥。結論：食源性沙門氏菌中也檢測到較高的耐藥率及整合子攜帶率,提示我們應該從基因水平上對食源性致病菌耐藥及其傳播進行監測。

沙門氏菌,第Ⅰ類整合子,耐藥基因盒,耐藥性

沙門氏菌(Salmonella)廣泛分布于自然界,能夠引起食源性感染,是對人類和動物健康有極大危害的一類致病菌。沙門氏菌是引起腹瀉的重要病原微生物之一,據統計,我國細菌性食物中毒中,有70%～80%是由沙門氏菌引起的[1]。近年來,世界各國都加強了食品安全工作,但是食品安全問題還是層出不窮。一方面食品生產是一個時間長、環節多的復雜過程,在整個過程中存在著許許多多被致病性微生物污染的可能性；另一方面,隨著越來越多食品生產者在生產源頭上濫用各種抗菌藥物,造成了致病性微生物耐藥菌株的大量出現,使得致病性微生物耐藥性不斷增強,并廣泛傳播。不斷蔓延的細菌耐藥(Bacterial Resistance)問題已成為食品安全重大隱患之一,對人類的生命和健康構成了巨大的威脅。因此,系統地分析食源性細菌的耐藥性,對了解和解決細菌感染等食品安全事件具有重要作用。在對細菌耐藥機制的探討中,整合子系統介導的細菌耐藥調控機制引起了廣泛的關注[2]。整合子是細菌基因組中一種介導耐藥基因轉移的轉座元件,其功能與耐藥基因的產生密切相關[3-4]。典型的整合子結構由保守區和可變區組成,保守區是整合酶編碼基因的所在區域,可變區是由耐藥基因盒組成；其中最常見的整合子為Ⅰ類整合子。關于Ⅰ類整合子結構、耐藥基因盒的捕獲及表達,相關的研究報道較多[5-8]。相關研究結果表明,Ⅰ類整合子可以攜帶至少數十種耐藥基因盒,所含耐藥基因幾乎覆蓋了臨床上所有使用的抗生素[9]。然而,前期的研究多集中在臨床菌株的研究,對食源性致病菌的報道較少。本研究對從超市食品樣品中分離得到32株食源性沙門氏菌中第Ⅰ類整合子的分布及其整合的耐藥基因盒進行了檢測并分析其耐藥基因,進一步探討了整合子在食源性致病菌耐藥中的介導作用,從基因角度研究了這些菌株的耐藥性,為食源性致病菌安全控制技術的實施提供理論依據和基礎數據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

沙門氏菌 均分離于廣州地區超市零售食物中,菌株來源見表1；第Ⅰ類整合子陽性對照菌株PseudomonasaeruginosaPAH15 本實驗室保藏；第Ⅰ類整合子陰性對照菌株為對利福平耐藥的含有pET196質粒大腸桿菌RG488 本實驗室保藏；藥敏實驗質控菌株大腸桿菌ATCC25922 本實驗室保存；藥敏實驗質控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853 本實驗室保存；OMEGA Kits 試劑盒 飛揚生物公司；DNA Marker DGL5000,10×Loading Buffer,2×Taq Master Mix NEW ENGLAND BioLabs；14種抗生素分別為頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、復方新諾明、環丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦 北京天壇藥物生物技術開發公司。

表1 實驗菌株來源

注：本實驗研究的沙門氏菌(S1-S32)均由廣東檢驗檢疫技術中心惠贈。

磁珠提取DNA系統RS-232C Thermo公司；PCR儀、凝膠成像分析系統UNIVERSAL HOOD Ⅱ 美國BIO-RAD儀器有限公司；瓊脂糖凝膠電泳系統GE-100 HANGZHOU BIOER公司。

1.2藥敏檢測

采用選取的14種抗生素對食源性沙門氏菌進行藥敏實驗,實驗步驟參照美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)紙片擴散法(K-B紙片法)標準,實驗結果判斷采用美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準[10]。

1.3聚合酶鏈式反應(PCR)篩選第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌

1.3.1 DNA模板的制備和引物的設計

1.3.1.1 沙門氏菌DNA的提取 參考文獻[11]的方法。

1.3.1.2 引物設計 參考文獻[6]的方法。分別用來擴增整合酶基因intI1、耐藥基因盒和3′CS。引物序列見表2。

表2 引物序列

注：引物由invitrogen公司合成。

1.3.2 PCR反應檢測第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌 用PCR儀檢測第Ⅰ類整合子,登陸國際生物信息庫GenBank,50μL PCR反應體系,擴增程序參照文獻[6],產物分析采用含有EB(溴化乙錠)的瓊脂-糖凝膠電泳方法,凝膠成像系統成像檢測。以銅綠假單胞菌 PAH15為第Ⅰ類整合子陽性對照菌,以對利福平耐藥且含有pET196質粒的大腸桿菌RG488為第Ⅰ類整合子陰性對照菌,對食源性沙門氏菌進行第Ⅰ類整合酶基因intI1擴增,出現陽性結果則判為第Ⅰ類整合子陽性菌株。

1.4耐藥基因盒擴增產物的純化、測序和序列分析

以第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌作為實驗菌株,制備DNA 模板和設計引物[6],PCR 反應體系和PCR擴增程序均與1.3.1相同,上海美吉公司完成PCR擴增產物的測序過程。應用DNAMAN軟件對耐藥基因盒PCR擴增產物的DNA序列進行開放讀碼框(ORF)分析,登陸美國國家生物技術信息中心DNA數據庫GenBank,進行DNA序列同源性比對分析。

1.5限制性內切酶酶切反應

利用DNASIS軟件確定限制性內切酶,對特異性引物in-F、in-B擴增出的相同片段進行酶切反應。酶切反應體系組成為8μL的PCR擴增產物,2μL酶緩沖液,1μL內切酶,10μL無菌去離子水,將其置于37℃恒溫條件下反應,1h后加入3μL 10×Loading Buffer終止反應,用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物[12]。

2 結果與分析

2.1菌株藥敏檢測結果

表3 食源性沙門氏菌藥敏檢測結果

注：S表示敏感,I表示中度敏感,R表示耐藥。

根據NCCLS推薦的標準,檢測了32株食源性沙門氏菌對14種抗生素的敏感性。本實驗所檢測的食源性沙門氏菌對頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星都敏感；對磺胺類藥物復方新諾明的耐藥率最高,達到25.00%；對β-內酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類都有部分耐藥性。結果表明,食源性沙門氏菌對臨床使用的抗菌藥物具有一定的多重耐藥性,且細菌的多重耐藥性一般與Ⅰ類整合子密切相關[4]。32株食源性沙門氏菌對檢測的14種抗生素的耐藥性見表3。

由表3可知,食源性沙門氏菌對檢測的14種抗生素耐藥率相對較低,均低于30%,但是對四大類抗生素均有耐藥。β-內酰胺類最高耐藥率達到18.75%,氨基糖苷類達到12.50%,喹諾酮類達到6.25%,磺胺類達到25.00%。

2.2第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌檢測結果

陽性沙門氏菌PCR擴增產物凝膠成像見圖1。由圖1可知,32株食源性沙門氏菌中,用上游引物int-U、下游引物int-D擴增整合酶基因intI1,共有19株沙門氏菌得到了923bp的擴增產物,和預測擴增產物片斷大小相符,推測可能為第Ⅰ類整合子陽性菌株,同時對其片斷進行純化,測序分析結果表明與923bp大小intI1(Y18050)100%同源,確認為intI1。沙門氏菌第Ⅰ類整合子陽性菌：S1、S3、S4、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S13、S15、S17、S19、S20、S21、S27、S28、S29、S30；第Ⅰ類整合子陽性檢出率為59.4%。

圖1 特異性引物int-U和int-D 擴增整合酶基因intI1 PCR產物部分電泳結果

圖2 特異性引物in-F和in-B 擴增第Ⅰ類整合子陽性菌PCR產物部分電泳結果

2.3耐藥基因盒擴增序列分析

用in-F和in-B特異性引物擴增第Ⅰ類整合子陽性菌整合的耐藥基因盒,結果表明,共有14株(74%)有擴增產物,分別是S1、S3、S4、S6、S7、S8、S13、S15、S17、S19、S20、S21、S27、S30；其余5株沙門氏菌未見有擴增產物,可能是并未捕獲耐藥基因或者耐藥基因未表達。PCR擴增結果見圖2,擴增產物大小為1009bp和1664bp。2株菌S6和S15擴增得到1664bp PCR產物,對其一片段進行測序,序列分析表明該片段(AB189264)含有2個開放閱讀框,大小分別為474bp和789bp,與耐藥基因盒aadA5和dfr17 100%同源,分別對氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類藥物甲氧芐氨嘧啶產生耐藥。所有菌株擴增得到1009bp PCR產物,對其一片段進行測序,序列分析表明該片段(FJ594765.1)與耐藥基因盒aadA2 100%同源,介導對氨基糖苷類抗生素、鏈霉素產生耐藥。另外,從2株菌S6和S15同時擴增出1664bp和1009bp的PCR產物,其序列分析與前述相同。

2.4耐藥基因盒長度多態性分析結果

用特異性內切酶對1664bp和1009bp耐藥基因盒進行酶切,特異性引物in-F、in-B擴增結果表明,2個1664bp片段都含有aadA5和dfr17耐藥基因,所有1009bp片段都含有aadA2耐藥基因,酶切結果見表4。用qacEΔ1-F和Sul1-B擴增以上19株第Ⅰ類整合子陽性沙門氏菌的3′CS,擴增產物均為800bp,和文獻[13]一致。說明19株陽性沙門氏菌的3′CS是完整的。耐藥基因盒結構示意圖見圖3。

表4 耐藥基因盒酶切結果

圖3 耐藥基因盒結構示意圖

3 討論

近年來,整合子介導的細菌耐藥成為國內外學者研究的熱點。然而,目前整合子研究報道主要集中在臨床菌株[14-15]。本實驗從基因角度研究分離自食品的沙門氏菌其整合子介導的細菌耐藥性。檢測到第Ⅰ類整合子陽性菌株所占比例為59.4%。PCR特異性擴增第Ⅰ類整合子陽性菌株的耐藥基因盒,14株均有擴增產物且片段大小分別為1009bp和1664bp。2株中PCR擴增產物片段大小為1664bp,攜帶aadA5和dfr17基因,編碼介導氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類藥物甲氧氨芐嘧啶耐藥的基因。14株中PCR擴增產物片段大小為1009bp,攜帶aadA2基因,編碼介導氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素耐藥的基因。2株菌同時擴增得到1009和1664bp的擴增產物,分析可能含有2個拷貝數的整合子,一個含有aadA5和dfr17耐藥基因盒,另一個含有aadA2耐藥基因盒,同時編碼介導對氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類藥物甲氧氨芐嘧啶耐藥的基因。以上2種結構的3′CS都含有sulI,是對磺胺類藥物的耐藥基因,這與藥敏檢測結果一致,對磺胺類抗生素復方新諾明有較高的耐藥性,達到25%。藥敏檢測結果中有18.75%對β-內酰胺類耐藥,但是在耐藥基因盒中并未檢測出對β-內酰胺類耐藥的基因,可能是因為本次實驗只檢測了第Ⅰ類整合子及其攜帶的基因盒,并未對其他類型的整合子進行檢測,分析其耐藥基因。

整合子耐藥系統對于監測細菌耐藥性的傳播具有重要意義[17]。整合子可以作為轉座子的組成部分參與耐藥基因的轉移,也可存在于染色體上,隨DNA的復制進入到子代中。多數整合子并不只是捕獲1個耐藥基因盒,它可以同時捕獲多個耐藥基因盒,介導對多種抗生素的耐藥性。多重耐藥菌株的出現,加大了臨床治療細菌感染的難度,而在食品中由于多重耐藥菌株的存在,導致了新的食品安全問題。本文從食源性細菌中檢測出了整合子及耐藥基因盒的存在,提示要從基因角度研究食品安全問題,為食源性致病菌安全控制技術的實施提供理論依據和基礎數據。

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Detection of classⅠintegron from foodbornesalmonellaand analysis on the drug resistance gene cassettes

ZHOURong,LILin,SUJian-yu*,LIBing,XUZhen-bo

(College of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Objective:To investigate the drug resistance,the distribution of class Ⅰintegron and drug resistance gene cassette of foodbornesalmonella. Methods:K-B assay was applied to measure the drug resistance of foodbornesalmonellaisolated against fourteen antibiotics. The class Ⅰintegron and drug resistance gene cassette were detected by PCR sequencing of amplification products. Results:The highest drug resistance rate to β-lactams,aminoglycosides,quinonones and sulfa in foodbornesalmonellawas 18.75%,12.5%,6.25% and 25%. 59.4%(19/32)of foodbornesalmonellawere positive for classⅠintegron. The product by PCR amplifying of classⅠintegron was 1009bp and 1664bp. In the drug resistance cassettes of variable regions of classⅠintegrons there were 3 types drug resistance genes,includingaadA5,dfr17 andaadA2,which induced the resistance to aminoglycosides antibiotics spectinomycin,streptomycin and sulfonamides drugs trimethoprim. Conclusion:High multidrug resistance and class I integron carrying had been identified among the foodbornesalmonella. The result stressed the need for continued surveillance of foodborne antibiotic resistance bacteria in the molecular level.

Salmonella;class Ⅰintegron;resistance gene cassette;drug resistance

2013-05-29 *通訊聯系人

周蓉(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：病原微生物及功能抗菌劑制備。

教育部博士點基金新教師基金項目(20110172120033);國家自然科學基金(31101278和31201362)資助。

TS201.1

：A

：1002-0306(2014)01-0279-05