烏骨雞黑色素三步法提取及結構性狀研究

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(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047； 2.南昌大學科學技術學院,江西南昌 330029)

烏骨雞黑色素三步法提取及結構性狀研究

黃宇玫2,田穎剛1,*,朱勝1

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047； 2.南昌大學科學技術學院,江西南昌 330029)

采用“脫脂-酶解-酸解”三步法提取烏骨雞黑色素,研究酸液脫除蛋白,分離烏骨雞黑色素的工藝條件,通過透射電鏡對烏骨雞黑色素純化效果進行觀察,并用元素分析儀對其結構進行分析。結果表明：最佳脫脂工藝為乙醇回流脫脂4次,每次1h,料液比1∶2,此工藝條件下烏骨雞油脂得率7.5%。脫脂后用蛋白酶C進行酶解,酸化的最優工藝鹽酸濃度為2mol/L,回流時間為3h,固液比為1∶10,回流次數為4次,此條件下雜質脫除率最高,且條件溫和,通過透射電鏡可見三步法純化的黑色素顆粒形態完整,邊緣清晰平滑,無破壞痕跡,可用于降解和結構研究。根據元素分析儀推測烏骨雞黑色素是一類有別于真黑色素及脫黑色素的特殊黑色素。

烏骨雞,黑色素,提取,酶解,結構

烏骨雞是江西省重要的地方資源,它與其他雞種最大的區別在于其體內富含黑色素。李時珍在本草綱目里說,骨頭與肉都呈黑色的烏骨雞食用時藥效最好,由此說明烏骨雞黑色素是烏骨雞發揮藥效的一個最重要的物質基礎,而近代科研工作者也發現烏骨雞黑色素具有許多特殊的生理活性,如抗誘變、延緩衰老、抑制流感病毒等[1-3]。因此,烏骨雞黑色素具有潛在的研究與應用價值。烏骨雞黑色素是一類結構復雜且與蛋白質緊密結合的大分子多聚體[4]。目前,提取烏骨雞黑色素的方法主要有鹽酸水解法[5]、蛋白酶水解法[6]及雙酶水解結合堿液除蛋白法等[7]。這些方法在提取烏骨雞黑色素時只考慮了烏骨雞黑色素獲得,而忽略了對烏骨雞的綜合利用。本文結合前人的工作基礎,運用“脫脂-酶解-酸解”三步法,為烏骨雞的深入研究與開發提供借鑒,為促進江西省烏骨雞產業的發展,深入開發我國特有資源做一些基礎性研究。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

烏骨雞 70～80日齡,雌雄各半,購自江西泰和縣；木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶 廣東諾維信酶制劑有限公司；無水乙醇、氯仿、甲醇、石油醚、無水乙醚、鹽酸、酚酞、氫氧化鈉 均為國產分析純。

SXC12型絞肉機 上海雙蝶廚具有限公司大溪分公司；XB220A電子分析天平 瑞士Prcisa；JJ-1精密增力電動攪拌器 常州國華電器有限公司；SHB-Ⅲ 循環水式多用真空泵 鄭州長陳科工貿易有限公司；Anke TGL-16C 離心機 上海安亭科學儀器廠；SPI型傅里葉紅外光譜儀 美國Perkin-Elmer；HITACHI H-600型透射電子顯微鏡 日本日立；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；EuroVector EA3000元素分析儀 美國利曼;HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;WH-861 微型漩渦混合儀 江西省日博工貿有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 烏骨雞原料脫脂工藝的優選 取泰和烏骨雞,宰殺,去毛、頭、爪、內臟,洗凈,用絞肉機絞成肉泥,加入無水乙醇,90℃回流,趁熱過濾,濾液濃縮并60℃真空干燥,得烏骨雞油脂,濾渣60℃烘干得烏骨雞干肉[8]。

選擇回流次數、肉泥與無水乙醇的料液比、回流時間作為考察的因素,以所提油的得率為指標,采用L16(45)正交表安排實驗,并對結果進行方差分析和顯著性判斷,以確定降解方法的最優組合,正交實驗因素與水平見表1,相關數據用SPSS13.0軟件進行處理。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.2 酶解制備粗黑色素的5種不同的蛋白酶及蛋白酶組合 取1.2.1最優條件所獲烏骨雞干肉6份,每份100g,加入6倍質量的水,90℃預煮30min,冷卻至一定溫度,參考文獻[9],分別選擇蛋白酶A-E進行水解,保溫攪拌2h后90℃滅酶30min,趁熱過濾,濾液濃縮并于60℃下真空干燥,稱重,即獲得烏骨雞活性肽,濾渣烘干。以蛋白脫除率為指標初步篩選合適蛋白酶,蛋白酶用量及水解溫度見表2。

蛋白脫除率(%)=烏骨雞干肉重(g)-酶解殘渣重(g)/烏骨雞干肉重(g)×100

表2 蛋白酶用量及其水解溫度

1.2.3 鹽酸酸解純化烏骨雞黑色素工藝條件的確定 烏骨雞黑色素與蛋白質結合緊密,提取得到的烏骨雞黑色素粗品中含有大量的蛋白質,因此烏骨雞黑色素的分離關鍵是脫除蛋白質,本實驗采用鹽酸酸解純化烏骨雞黑色素,分別對鹽酸濃度、回流時間、固液比、回流次數4個指標做單因素考察,以雜質脫除率作為評價指標。

1.2.3.1 鹽酸濃度單因素實驗 稱取干燥黑色素粗品6份,每份6g,分別加入濃度為0.5、1、2、4、6、8、10mol/L的鹽酸溶液60mL,于90℃回流3h,冷卻后過濾,濾液濃縮、水浴蒸干,稱重,濾渣用蒸餾水洗滌至中性,60℃烘干。計算各組分雜質脫除率。

1.2.3.2 回流時間單因素實驗 稱取干燥黑色素粗品5份,每份6g,加入濃度為2 mol/L的鹽酸溶液60mL,于90℃分別回流1、2、3、4、5h,冷卻。濾液中干物質處理同1.2.3.1。

1.2.3.3 固液比單因素實驗 稱取干燥黑色素粗品5份,每份6g,分別以固液比為1∶4、1∶7、1∶10、1∶13、1∶16的比例加入2mol/L的鹽酸溶液,于90℃回流3h,冷卻。濾液中干物質處理同1.3.3.1。

1.2.3.4 回流次數單因素實驗 稱取干燥的黑色素粗品一份20g,以固液比1∶10的比例加入2mol/L的鹽酸溶液,90℃回流3h,冷卻,過濾。重復5次,濾液分別濃縮、水浴蒸干,稱重。濾渣用蒸餾水洗滌至中性,60℃烘干。計算雜質脫除率。

1.2.4 研究烏骨雞黑色素的理化性質

1.2.4.1 不同方法精制的烏骨雞黑色素形態觀察 比較雙酶-堿液脫除蛋白法、本項目優化的脫脂-酶解-酸解三步精制法、酸提取法所得黑色素的形態差別。酸提取法：將烏骨雞雞肉、雞皮剁細后用6mol/L鹽酸按40mL/g比例浸泡8.0h,然后100℃水浴回流1.5h,在加熱回流后進行快速冷凍,用小匙除去其油塊得到烏骨雞黑色素。

雙酶-堿液脫除蛋白法：取泰和烏骨雞肉泥加3倍的水,0.25%的木瓜蛋白酶,(63±1)℃酶解3h,降溫至(54±1)℃,再加入0.15%的復合蛋白酶,繼續酶解2h,升溫煮沸0.5h,滅酶,靜置分層,抽出上層黑色素懸浮液,在4800r/min條件下離心15min,棄去上清液,得黑色素粗品。取酶解后黑色素粗品5g,加入pH10的氫氧化鈉溶液50mL,50℃水浴加熱并攪拌2h,離心后得烏骨雞黑色素。

脫脂-酶解-酸解三步精制法：取泰和烏骨雞肉泥加2倍的無水乙醇,90℃回流4次,每次1h,趁熱過濾,濾渣60℃烘干得烏骨雞干肉。干肉加入6倍質量的水,90℃預煮30min,冷卻至一定溫度,選擇蛋白酶C進行水解,保溫攪拌2h后90℃滅酶30min,趁熱過濾,濾液濃縮并于60℃下真空干燥得黑色素粗品,稱取酶解后黑色素粗6g 至反應瓶,加入濃度為2mol/L的鹽酸溶液60mL,90℃回流3 h,冷卻后過濾,濾渣用蒸餾水洗滌至中性,60℃烘干得烏骨雞黑色素。

取少量干燥的三種精制烏骨雞黑色素,與適量乙醇混合,用超聲的方法將樣品盡量分散成均勻混合液,用玻璃毛細管吸取混合液滴2～3滴在微柵網上,置HITACHI H-600型透射電鏡下進行觀察并記錄,工作電壓75kV。

1.2.4.2 元素分析 取少量干燥的脫脂-酶解-酸解三步法精制烏骨雞黑色素按JY/T 017-1996 元素分析儀通則[10]進行分析。

2 結果與討論

2. 1正交實驗優化結果

烏骨雞雞肉乙醇脫脂的正交實驗結果及方差分析見表3、表4。由表3的極差分析結果可知,三個因素的主次順序為：回流次數>回流時間>料液比。根據極差分析得到的烏骨雞油得率最高的條件是：回流次數為4次,回流時間為1h,料液比為1∶2。經實驗驗證,在此條件下,烏骨雞油脂得率為7.5%。根據方差分析結果可知：各因素在正交實驗所選水平下,對烏骨雞油脂得率都有影響,回流次數對其影響顯著(p<0.05),但回流時間和料液比對其影響無統計學差異(p>0.05)。

表3 正交實驗結果分析表

表4 正交實驗結果的方差分析表

2. 2各種蛋白酶對蛋白的脫除效果

要獲得比較純凈的黑色素,就必須盡可能的將與黑色素緊密相連的蛋白質等雜質去除。蛋白酶A、B、C、D、E及復合酶D+E的水解效果如圖1。由結果可知,蛋白酶C的蛋白脫除率最高,可達59.79%,因此,選擇蛋白酶C進行蛋白脫除。

圖1 各種蛋白酶對蛋白的脫除效果

2.3烏骨雞黑色素的提取工藝考察結果

2.3.1 鹽酸濃度對雜質脫除率的影響 鹽酸濃度對雜質脫除率的影響見圖2,由圖可知,鹽酸濃度小于1mol/L時,鹽酸濃度的變化對雜質脫除率的影響不大；當鹽酸濃度大于1mol/L時,隨著濃度的增加,雜質脫除率顯著提高；在2mol/L處,脫除率顯著增加,達到48.25%；繼續增加鹽酸濃度,雜質脫除率有緩慢增加的趨勢。但鹽酸濃度太大可能會對黑色素的結構造成破壞,且在實驗操作方面有較大的危險性,綜合以上因素,選擇2mol/L為最佳鹽酸濃度。

圖2 鹽酸濃度對雜質脫除率的影響

2.3.2 回流時間對雜質脫除率的影響 回流時間對雜質脫除率的影響見圖3,由圖可知,回流時間在3h之內,雜質脫除率呈大幅增高的趨勢,且在該段時間內雜質脫除率與回流時間幾乎成線性關系。回流3h后,雜質脫除率無明顯增加,說明在此條件下即使增加回流時間也無法提高雜質的脫除率,一個原因可能隨時間的延長反應液中鹽酸濃度已經降低,已經無法繼續水解雜質；另外一個原因是該鹽酸濃度已經無法水解一些特殊的蛋白及以特殊結構連接在黑色素上的蛋白。因此,選擇3h為最佳回流時間。

2.3.3 固液比對雜質脫除率的影響 固液比對雜質脫除率的影響見圖4,由圖可知,固液比在1∶4至1∶10之間,雜質脫除率呈逐漸增高的趨勢,當固液比達到1∶10后,隨著固液比的增大雜質脫除率增加非常緩慢,幾乎不變,從經濟角度考慮選擇1∶10為最佳固液比。

圖3 酸解時間對雜質脫除率的影響

圖4 固液比對雜質脫除率的影響

2.3.4 回流次數對雜質脫除率的影響 回流次數對雜質脫除率的影響見圖5,由圖可知,隨著回流次數的增加,雜質脫除率不斷增加,但在初始階段(回流1～3次),雜質脫除率與回流次數幾乎呈線性正相關,當回流3次后,雜質脫除率趨于平緩,說明此時增加回流次數對雜質脫除率已無太大的影響。結合圖6可知,當雜質脫除率與回流次數成正相關時,烏骨雞黑色素粗品中含氮百分率與回流次數正好成負相關,說明脫除的雜質中含有大量的氮元素,可能是包裹在烏骨雞黑色素周圍的蛋白質,當回流次數超過4次后,烏骨雞黑色素粗品中氮含量變化基本趨于平緩,考慮到蛋白含量太高會影響后期實驗中烏骨雞黑色素的降解及其降解產物的分離,為盡量減少雜質的干擾,因此,選擇最佳回流次數為4次。

圖5 回流次數對雜質脫除率的影響

圖6 回流次數對烏骨雞黑色素粗品氮含量的影響

2.4烏骨雞黑色素性狀的分析結果

2.4.1 不同方法精制的烏骨雞黑色素的形態比較 如圖7所示,在透射電鏡下各種不同方法精制的烏骨雞黑色素形態不同,采用雙酶-堿液脫除蛋白法提取的黑色素(圖中E-Alkali)在12000倍電鏡下呈現塊狀形態,塊狀邊緣棱角分明；采用本項目優化的三步精制法所獲烏骨雞黑色素(圖中E-Acid)在12000倍時呈現為多個橢圓形顆粒的聚合物,且多聚體邊緣呈現為橢圓形凹凸不平狀,可隱約觀察到黑色素顆粒形態。在40000倍電鏡下與酸法提取的烏骨雞黑色素(圖中Acid)進行對比,黑色素顆粒數明顯較多,其外部形態基本相似,這些橢球形顆粒形態完整,邊緣清晰平滑,無破壞痕跡,可為后期烏骨雞黑色素結構研究提供了性質穩定、純凈的原料來源。

圖7 烏骨雞黑色素透射電鏡圖

2.4.2 精制烏骨雞黑色素的元素分析 元素分析表明,精制烏骨雞黑色素中C、H、N三種元素的質量分數接近于合成真黑色素,但其S元素的含量高于合成真黑色素,又遠低于脫黑色素。表明烏骨雞黑色素可能是一類以真黑色素結構為主混合著少量脫黑色素結構的一類特殊黑色素。且烏骨雞黑色素C元素的含量略高于其它兩類黑色素,推測其含有脂肪族結構。

表5 三類黑色素中有機元素質量百分比

3 結論與討論

目前烏骨雞黑色素的結構尚不明確,被認為是一類與蛋白質結合緊密,且結構復雜的大分子多聚體[11-14]。鹽酸水解法是早期使用較為廣泛的提取黑色素的方法,鹽酸可有效去除附著于黑色素周圍的蛋白,但該法使用的鹽酸濃度較高、酸解時間較長,可能會對黑色素的外部形態及內部化學結構造成破壞。因此有學者開始采用蛋白酶酶解技術提取黑色素。酶水解法水解溫和,能盡量保持黑色素結構,但使用該法所獲黑色素的蛋白質含量較高,其純度往往不及鹽酸水解法所獲黑色素,這給黑色素的結構研究帶來極大的不便。前期本課題組在此基礎上采用雙酶水解結合堿液除蛋白的方法提取分離烏骨雞黑色素,該法只能一定程度上脫除黑色素周圍的部分蛋白,制備的黑色素較適合進行功能研究,由于蛋白脫除不徹底不利于黑色素結構研究。本實驗提出的“脫脂-酶解-酸解”三步法可將附著在烏骨雞黑色素周圍的蛋白質去除干凈,投射電鏡下可觀察到游離的規則橢球顆粒的烏骨雞黑色素,表明此法所獲得的烏骨雞黑色素周圍無明顯附著物,減少了多余蛋白質對烏骨雞黑色素結構分析的影響,可為后期烏骨雞黑色素的結構研究提供較為純凈、性質穩定的原材料。

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Three stage extraction and structural characters of melanin from black-bone silky fowl

HUANGYu-mei2,TIANYing-gang1,*,ZHUSheng1

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China; 2.Nanchang University College of Science and Technology,Nanchang 330029,China)

This study aimed to develop a method to extract melanin from black-bone silky fowl muscle by Skim-enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis,to find better separation conditions of black-bone silky fowl melanin. The melanin was observed by Transmission Electron Microscope,and analyzed by element analyzer. The optimal conditions for protamex hydrolysis of black-bone silky fowl muscle were determined as follows:refluxing 4 times,refluxing time 1h,and solid-liquid ratio 1∶2.Under this condition the removal rate was 7.5%.Then it was found that more melanin with a lower protein level was prepared from black-bone silky fowl muscle by the protease C,optimal acidification condition was hydrochloric concentration 2mol/L,refluxing time 3h,liquid-solid ratio 1∶10,refluxing 4 times. Under this condition of the impurity removal rate was the highest. Through transmission electron microscopy the melanin by three-step purified was ellipsoidal and shape integrity particle,with clear and smooth borderline and without destruct. Element analysis of melanin showed that the melanin from black-bone silky fowl might be a specail melanin which was different with eumelanin and phomelanin.

black-bone silky fowl;melanin;extraction;enzymatic;structure

2013-06-28 *通訊聯系人

黃宇玫(1983-)，女，碩士，講師，研究方向：天然產物提取及藥效研究。

國家自然科學基金項目(20962015)；江西省自然科學基金項目(2009GZN0087)；江西省教育廳科技項目(GJJ10308)。

TS251.55

：B

：1002-0306(2014)01-0249-05