響應面法優化BacillusamyloliquefaciensZJHD-06產類細菌素發酵培養基

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(廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省普通高等學校水產品深加工重點實驗室,廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524000)

響應面法優化BacillusamyloliquefaciensZJHD-06產類細菌素發酵培養基

安俊瑩,劉穎*,朱雯娟,胡雪瓊,葉莉珍

(廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省普通高等學校水產品深加工重點實驗室,廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524000)

以分離自海洋寶石石斑魚腸道的一種解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06所產類細菌素為研究對象,以單核增生李斯特菌為抗菌活性測試指示菌,以抑菌圈直徑大小為指標,采用響應面法對菌株ZJHD-06產類細菌素的發酵培養基成分進行優化。通過Plackett-Burman 實驗篩選出對類細菌素產量具有顯著影響的因素,再通過最陡爬坡實驗確定顯著因素的中心水平,最后進行Box-Behnken實驗設計,最終得到的最佳配比為葡萄糖濃度4.80%,蛋白胨濃度0.47%,酵母浸膏濃度0.44%,NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O濃度分別為1.0%、0.01%、0.03%。在該培養基配比下,發酵上清液的抑菌圈直徑增加了27.8%。

響應面,類細菌素,發酵培養基

細菌素是某些細菌在代謝過程中,通過核糖體合成機制產生的一類具有抑菌活性的多肽、蛋白質或蛋白質復合物,但它通常具有較窄的抑菌譜,只能殺死或抑制與其親緣關系近的其他微生物[1-2],這一性質使它的應用受到了一定的限制。隨著對細菌素研究的不斷深入,研究者發現了一些不符合或是完全不符合細菌素定義的蛋白類拮抗物質,不僅能抑制革蘭氏陽性菌還能抑制革蘭氏陰性菌和真菌,并被稱之為類細菌素[3]。由于它們具有高效、無毒、無殘留,并且能有效地抑制食品腐敗菌與致病菌的生長,近年來,它們作為有潛力的、結構新穎的天然食品防腐劑得到了廣泛的研究[4]。目前,雖然已經有乳酸菌、鏈霉菌、銅綠假單胞菌、芽孢桿菌屬[5-8]等產生類細菌素的報道,但是受化學結構和作用機理不明確、產量低、生產成本高等因素的制約,真正實現工業應用的類細菌素只有乳酸鏈球菌素(Nisin)[9]。提高產量成為工業應用要解決的關鍵問題之一。微生物的生長和代謝產物的積累受培養基的組分如碳源、氮源、生長因子、無機鹽等多種因子的影響,因此優化發酵培養基成分是一個提高類細菌素產量的有效辦法[10]。響應面法(response surface methodology,RSM)是利用合理的實驗設計,建立多元二次方程模型來擬合因素和響應值之間的函數關系,通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝,解決多變量問題的一種統計學方法,該法被廣泛應用于農業、生物、食品、化工等領域[11]。本研究利用響應面法對從海洋寶石石斑魚腸道中分離得到一株產類細菌素的解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06(BacillusamyloliquefaciensZJHD-06)的發酵培養基進行優化,以提高類細菌素的產量,為新型天然食品防腐劑的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06(BacillusamyloliquefaciensZJHD-06) 本實驗室分離得到；單核增生李斯特菌(ListeriamonocytogenesATCC 35152) 廣東省微生物研究所提供；營養肉湯(NB)、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA)、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB) 北京陸橋技術責任有限公司。

YXQ-LS-50SI立式壓力蒸汽滅菌器、SPX-150B-Z恒溫培養箱、SW-CJ-2F超凈工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HZQ-R恒溫搖床 東聯電子技術開發有限公司；3-18K冷凍離心機 Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1 菌種發酵及上清液的制備 采用營養肉湯培養基將B.amyloliquefaciensZJHD-06連續活化2代,每代30℃、200r/min下培養12h。活化后菌液按3%接種量接種至每個實驗培養基(50mL/250mL錐形瓶),30℃、200r/min下培養72h。將各發酵液于12000r/min 4℃離心15min,收集上清液,并用0.22μm的濾膜過濾,濾液的pH調至7.0,4℃下保存備用。

1.2.2 Plackett-Burman實驗設計 對影響發酵結果的培養基中的碳源(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉),氮源(蛋白胨、酵母浸膏、黃豆粉、綠豆粉),無機鹽(NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O)三大營養因子進行考察,采用Plackett-Burman法設計11因素2水平的實驗,以抑菌圈直徑為響應值,篩選影響類細菌素產量的主效因素,實驗因素水平及編碼見表1。實驗設計中低水平(-1)與高水平(1)的濃度是在菌株篩選時發酵培養基成分的基礎上經過預實驗所得。

表1 Plackett-Burman設計的因素水平及編碼

1.2.3 最陡爬坡實驗 以實驗結果即抑菌圈直徑變化的梯度方向為爬坡方向,根據各因素效應值的大小確定變化步長,能快速、經濟的逼近最佳區域。根據Plackett-Burman實驗得出的結果安排最陡爬坡實驗,實驗安排見表5。

1.2.4 Box-Behnken實驗設計 經Plackett-Burman實驗確定的主效因素作為設計因素,最陡爬坡實驗確定的最優水平作為中心水平,設計Box-Behnken實驗,實驗因素水平及編碼見表2。

表2 Box-Behnken實驗因素水平及編碼

1.2.5 類細菌素抗菌活性測定 指示菌懸液的制備：將L.monocytogenes按1%的接種量接種到用胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯37℃培養12h,之后用生理鹽水稀釋至OD600=0.6,4℃保存。

牛津杯雙層平板法[12]：先向滅菌平皿中加入約5mL素瓊脂,凝固后擺放已滅菌的牛津杯,再向平皿內加入含有指示菌菌懸液的胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂,凝固后取出牛津杯,向孔內加入100μL的發酵上清液,4℃下擴散2h后37℃培養24h,用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1影響類細菌素產量的主效因素的確定

本實驗采用N=12的Plackett-Burman實驗設計,用JMP7.0軟件對實驗數據進行分析。Plackett-Burman實驗安排及結果見表3。

根據分析各因素對響應值顯著性檢驗結果的p值來判斷各因子對實驗影響的程度,見表4。由表4可知,葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏三個因素為主效因子(p<0.05),它們對類細菌素產量影響顯著,尤其是葡萄糖(p<0.01)對類細菌素產量影響極顯著。因為無機鹽是微生物必不可少的生長因素,對于不顯著的無機鹽因素NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O在之后實驗中的濃度保持低水平,分別是1.0%、0.01%、0.03%。

表3 Plackett-Burman實驗安排及結果

表4 各因素對響應值的顯著性檢驗結果

注：**代表對實驗結果有極顯著影響(p<0.01),*代表對實驗結果有顯著影響(p<0.05),表8同。

2.2最陡爬坡路徑

由表4可知，葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏這三個因素對實驗結果影響都為正效應,所以在最陡爬坡實驗中它們的變化方向是逐漸增加的。根據這三個因素效應大小的比例設定它們的變化方向以及步長,無機鹽因素分別取各自的低水平進行實驗。實驗設計及結果見表5,可以看出葡萄糖濃度3.0%、蛋白胨濃度0.3%、酵母浸膏濃度0.3%時實驗抑菌圈直徑最大,所以以3.0%、0.3%、0.3%為葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏的中心水平設計Box-Behnken實驗。

2.3 Box-Behnken實驗設計及結果分析

2.3.1 二次回歸模型擬合及方差分析 以Plackett-Burman實驗確定的葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏這三個主效因素為設計因素,以最陡爬坡實驗確定的最優濃度為中心水平進行3因素3水平N=15的Box-Behnken設計,實驗設計及結果見表6。

表5 最陡爬坡實驗安排及結果

表6 Box-Behnken實驗設計及結果

根據實驗結果,運用JMP7.0軟件進行二次回歸分析,其回歸方程為Y=21.833+1.225X1+1.186X2+1.038X3-1.379X12+1.050X1X2+0.550X1X3-1.404X22+0.375X2X3-1.354X32。

表7 回歸方程的方差分析表

對回歸方程的各個因素進行顯著性檢驗的結果見表8。可知,葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、酵母膏濃度的一次項和二次項對類細菌素的產量影響極顯著,葡萄糖濃度和蛋白胨濃度的交互作用對類細菌素的產量都有顯著影響。

表8 回歸方程參數估計

2.3.2 響應面分析和最佳培養基配比確定 葡萄糖與蛋白胨、葡萄糖與酵母浸膏、蛋白胨與酵母浸膏之間的交互作用如圖1～圖3所示。

圖1 葡萄糖與蛋白胨交互作用的響應面圖

圖2 葡萄糖與酵母浸膏交互作用的響應面圖

圖3 蛋白胨與酵母浸膏交互作用的響應面圖

從圖1～圖3可以看出響應面都為開口向下的凸型曲面,說明實驗存在抑菌圈直徑的最大值。比較三個圖可以看出圖1的響應面陡峭程度最高,這說明了葡萄糖濃度和蛋白胨濃度對抑菌圈直徑的交互作用最明顯。這也許因為葡萄糖和蛋白胨是培養基中的主要碳源和氮源,碳源和氮源是細菌生長必不可少的因素。葡萄糖和蛋白胨的添加比例也對類細菌素的產量有著顯著的影響[13]。

對簡化的二次回歸方程Y=21.833+1.225X1+1.186X2+1.038X3-1.379X12+1.050X1X2-1.404X22-1.354X32進行求解得出極值點為X1=0.905、X2=0.853、X3=0.685,通過計算得出對應的葡萄糖濃度為4.810%,蛋白胨濃度為0.471%,酵母浸膏濃度為0.437%,預測的抑菌圈最大直徑為23.25mm?？紤]到實際發酵生產,得出發酵培養基的最佳配比為葡萄糖4.80%,蛋白胨0.47%,酵母浸膏0.44%,NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O保持低水平濃度分別為1.0%、0.01%、0.03%。

2.3.3 驗證實驗 為了驗證預測值的真實性,按照考慮實際生產所得的最佳配比做了3次重復實驗,實驗所得的平均值為22.98mm,只比預測的抑菌圈最大直徑少0.27mm,這說明預測值與真實值之間有良好的擬合度。

從驗證實驗結果可以看出,培養基優化后發酵上清液的抑菌圈直徑有了明顯的增加,這與一些文獻的實驗結果一致。如曹小紅等[14]利用響應面法優化BacillusnattoTK-1產脂肽發酵培養基使脂肽產量提高了約30%。劉國榮等[15]利用響應面法優化彎曲乳桿菌RX-6代謝產細菌素的發酵培養基組成時得到的最佳配方使得細菌素效價增加了2.46倍。

3 結論

本文采用響應面法對B.amyloliquefaciensZJHD-06產類細菌素發酵培養基進行了優化,首先利用Plackett-Burman實驗篩選出葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏這三個因素為主效因素,經過最陡爬坡實驗確定3%、0.3%、0.3%為中心水平后,進行Box-Behnken實驗設計,對實驗結果進行分析,得出產類細菌素的培養基的最佳配比為葡萄糖4.80%,蛋白胨0.47%,酵母浸膏0.44%,NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O保持低水平濃度分別為1.0%、0.01%、0.03%。運用該配比進行驗證實驗,抑菌圈的直徑高達22.98mm,比較之前的實驗結果抑菌圈直徑(平均直徑18.0mm)增加了27.8%。

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Optimization of fermentation medium ofBacillusamyloliquefaciensZJHD-06 by response surface methodology

ANJun-ying,LIUYing*,ZHUWen-juan,HUXue-qiong,YELi-zhen

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524000,China)

The fermentation medium ofBacillusamyloliquefacienZJHD-06 isolated from intestine ofEpinephelusareolatuswas optimized for a bacteriocin-like substance(BLS)production. Bacteriostatic circle diameter was used as evaluation index againstL.monocytogenesATCC 35152. Firstly,the notable factors were screened by Plackett-Burman experiment design. Then,the path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the significant factors. Finally,Box-Behnken design was adopted to identify optimal proportion. The results showed the optimal proportions were glucose 4.80%,peptone 0.47%,yeast extract 0.44%,NaCl 1.0%,K2HPO40.01% and MgSO4·7H2O 0.03%. The bacteriostatic circle diameter of the fermentation supernatant was increased by 27.8% using the optimal proportions.

response surface methology;bacteriocin-like substance;fermentation medium

2013-07-10 *通訊聯系人

安俊瑩(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源利用。

廣東省自然科學基金(S2011010000328)；廣東省科學技術廳(粵科規劃字[2009]198號)。

TS201.1

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：1002-0306(2014)01-0191-05