海藻酸鈉-殼聚糖固定化胃蛋白酶的研究

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(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030； 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心,黑龍江哈爾濱 150030)

海藻酸鈉-殼聚糖固定化胃蛋白酶的研究

李曉靜1,侯俊財(cái)1,*,江連洲1,朱秀清2,韓宗元1,吳瑤1,張佳秀1,高夢(mèng)妮1,韓巍巍1,曹秋閣1,耿浩1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030； 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心,黑龍江哈爾濱 150030)

采用海藻酸鈉-殼聚糖包埋交聯(lián)法對(duì)胃蛋白酶進(jìn)行固定化。以固定化酶的活力回收率為指標(biāo),探討了固定化的條件及固定化胃蛋白酶與游離胃蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：最優(yōu)固定化條件為,海藻酸鈉濃度為3.40%,殼聚糖濃度為3.39%,CaCl2濃度為3.64%,游離酶稀釋倍數(shù)20倍,交聯(lián)時(shí)間4h,固定化酶回收率74.87%±1.07%；固定化酶的最適溫度47℃,最適pH3.5；得到的固定化酶的操作穩(wěn)定性和熱力學(xué)穩(wěn)定性都較好,該固定化酶重復(fù)使用5次后,活力仍可以保持62%以上。

海藻酸鈉,殼聚糖,胃蛋白酶,固定化酶

酶作為一種天然的高效催化劑,已得到了廣泛的應(yīng)用,但游離酶具有不穩(wěn)定與易變性等缺點(diǎn),使產(chǎn)品的生產(chǎn)成本居高不下,這極大限制了其在食品工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用[1]。固定化技術(shù)是20世紀(jì)中期發(fā)展起來的一項(xiàng)新型生物技術(shù),起步于20世紀(jì)50年代,于1971年第1屆國(guó)際酶工程(EnzymoEngineerin)會(huì)議上正式采用了“固定化酶”的名稱[2]。近年來,固定化酶的載體和研究方法都有了很大的進(jìn)展,在現(xiàn)代食品行業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、能源開發(fā)等環(huán)境領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。固定化酶是用一定的材料將活性酶束縛或限制于一定的區(qū)域內(nèi),但仍能進(jìn)行酶所特有的催化反應(yīng),并可回收及重復(fù)使用的一種新技術(shù)[1],制得的固定化酶具有很高的穩(wěn)定性,在反應(yīng)過程中容易控制,可反復(fù)循環(huán)利用,延長(zhǎng)了酶的使用期限,同時(shí)增強(qiáng)了酶的使用效率,并降低了生產(chǎn)成本。 制備固定化酶的方法有很多種,其中包埋法制備固定化酶是不需要化學(xué)修飾酶蛋白的氨基酸殘基,且具有反應(yīng)條件溫和、酶活力損失小等優(yōu)點(diǎn),是常用于制備固定化酶的方法。吳國(guó)杰等[2]探討了海藻酸鈉-殼聚糖固定化載體的制備及應(yīng)用研究,對(duì)各因素的影響進(jìn)行了探討,為海藻酸鈉-殼聚糖作為載體提供了理論依據(jù),并充分說明殼聚糖-海藻酸鈉作為固定化載體的可行性。高尚欣等[11]探討了海藻酸鈉-殼聚糖共固定化菠蘿莖蛋白酶的研究,對(duì)影響因素進(jìn)行研究,詳細(xì)說明了各個(gè)條件的關(guān)鍵點(diǎn)。張佳寧等[7]探討了殼聚糖-海藻酸鈉固定化磷脂酶A2的研究,對(duì)制備過程中不同條件對(duì)結(jié)果的影響進(jìn)行了研究,為以后固定化酶打下良好的基礎(chǔ)。鑒于海藻酸鈉和殼聚糖均是無毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料,且具有一定的保健功能[2]。所以常用海藻酸鈉、殼聚糖作為包埋材料,制備固定化酶[3-4]。胃蛋白酶是從豬、牛或羊的胃粘膜中提取的,為白色粉末,無霉敗臭味,有引濕性,水溶液呈酸性的一種消化性動(dòng)物蛋白酶[5],適宜在酸性條件水解蛋白肽類。常用于助消化類的藥物中,又因其水解后的產(chǎn)物利于消化吸收,抗氧化性較好,被廣泛應(yīng)用在水解植物蛋白中,但因其穩(wěn)定性差,易受外界影響變性失活,且酶與底物混合反應(yīng)后難以回收利用,增加了生產(chǎn)成本。且酶與反應(yīng)產(chǎn)物混在一起,也給產(chǎn)物的后續(xù)分離純化帶來了不便,固定化酶相比于游離酶對(duì)熱、pH等條件的穩(wěn)定性有所提高,而且對(duì)酶抑制劑的敏感性降低,易于分離,改善了后處理過程[6]。本實(shí)驗(yàn)主要以殼聚糖-海藻酸鈉為載體,固定化胃蛋白酶,以提高酶的利用率,并對(duì)海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、CaCl2濃度和交聯(lián)時(shí)間等因素對(duì)固定化胃蛋白酶活力回收率的影響進(jìn)行研究,最終優(yōu)化出酶的最佳固定化條件。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

海藻酸鈉(脫乙酰度 85%) 天津市遠(yuǎn)航化學(xué)藥品有限公司經(jīng)銷；殼聚糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；戊二醛(50%) 天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；胃蛋白酶(1∶3000) 中國(guó)惠世生化試劑有限公司上海；酪蛋白 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乳酸和冰乙酸 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；碳酸鈉和乳酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司；三氯醋酸 江蘇市永華精細(xì)化學(xué)品有限公司；其他試劑均為分析純?cè)噭┗蛏噭?市售)。

LGJ-1 型冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；UV759CRT型紫外可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化胃蛋白酶的制備方法 稱取一定量的海藻酸鈉加水50mL,在37℃水浴鍋中保溫溶解一段時(shí)間,向海藻酸鈉溶液中加入5mL用pH2.3的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液稀釋一定倍數(shù)的酶液,使之?dāng)嚢杈鶆?靜置一段時(shí)間,同時(shí)稱取一定量的殼聚糖使之溶解在5%的HAc溶液中,并加入一定量的3% CaCl2溶液,在37℃水浴中充分混勻。用無菌的5號(hào)注射器將含有酶液的海藻酸鈉溶液以3滴/s的速度滴加到一定量的殼聚糖醋酸溶液與CaCl2混合溶液中,凝固2min,再加入一定濃度的戊二醛溶液,攪拌1.5h后,放在4℃冰箱中交聯(lián)一段時(shí)間。用蒸餾水洗滌,然后進(jìn)行冷凍干燥,即可得到固定化胃蛋白酶。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 游離酶添加量稀釋10倍,海藻酸鈉濃度為2%,殼聚糖濃度為2%,CaCl2濃度為3%,固定化時(shí)間2h,控制4因素不變,變化1個(gè)因素,游離酶添加量稀釋倍數(shù)5～25倍,海藻酸鈉濃度1%～5%,殼聚糖濃度1%～5%,CaCl2濃度2%～6%,固定化時(shí)間1～5h,來確定各因素對(duì)固定化效果的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素的基礎(chǔ)上,確定各因素的最佳水平值范圍,采用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究各固定化影響因素對(duì)固定化酶活力回收率的影響規(guī)律,并得到固定化胃蛋白酶的最佳條件。

以游離酶添加量(A)、海藻酸鈉濃度(B)、殼聚糖濃度(C)、氯化鈣濃度(D)、交聯(lián)時(shí)間(E)為自變量,固定化酶酶活回收率(R1)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。自變量水平編碼見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.2.4 游離蛋白酶與固定胃蛋白酶活力的測(cè)定 胃蛋白酶酶活力采用福林-酚法測(cè)定蛋白酶活力,即國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)SB/T13017-1999,固定化酶活力單位為U/g。

1.2.5 固定化酶活回收率的計(jì)算方法 固定化酶活性回收率(%)=(固定化酶活力/固定化前游離酶的活力)×100

1.2.6 固定化酶的性質(zhì)研究

1.2.6.1 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定比較 取一定量的固定化酶和游離酶,在不同的溫度下(17、27、37、47、57、67和77℃)測(cè)定游離酶與固定化酶的活力。

1.2.6.2 pH對(duì)固定化酶和游離酶酶活力的影響 取一定量的固定化酶和游離酶,分別在pH1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 和4.0條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的活力。

2 結(jié)果與討論

2.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.2.2福林-酚法,由測(cè)得數(shù)據(jù)繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=0.0069X+0.0068,R2=0.9995。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2固定化胃蛋白酶條件對(duì)固定化蛋白酶活力的影響

2.2.1 游離酶的稀釋倍數(shù)對(duì)固定化酶活力的影響 由圖2 可以看出,在稀釋5～20倍之間,隨著游離酶稀釋倍數(shù)的增加,固定化酶回收率緩慢增加,可能是由于當(dāng)稀釋倍數(shù)較低時(shí),相對(duì)游離酶濃度較大,載體上蛋白結(jié)合點(diǎn)達(dá)到飽和,酶分子之間相互聚焦,造成了酶活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,所以導(dǎo)致固定化酶回收率相對(duì)較低,而隨著稀釋倍數(shù)的增加,固定化酶回收率直線下降,主要是由于此時(shí)開始載體上的蛋白質(zhì)結(jié)合點(diǎn)未達(dá)到飽和,所以固定化酶回收率降低[8]。

圖2 游離酶的稀釋倍數(shù)對(duì)固定化胃蛋白酶活力的影響

2.2.2 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活力的影響 由圖3可以看出,當(dāng)海藻酸鈉濃度為3%時(shí),固定化酶回收率最高。在制備固定化酶時(shí),明顯看到,海藻酸鈉濃度是直接影響固定化酶成球的主要因素。當(dāng)海藻酸鈉濃度低于3%時(shí),固定化酶微球表面形成的固定化膜強(qiáng)度不夠,導(dǎo)致球型不飽滿,微球的凝膠孔徑較大,酶液容易流失,所以酶活較低；隨著海藻酸鈉濃度增大,固定化酶微球型比較飽滿結(jié)實(shí),但由于粘度的增大,制得的固定化酶容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,微球的凝膠孔徑也隨之變小,影響了酶與底物的結(jié)合,因此最適的海藻酸鈉濃度為3%。

圖3 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化胃蛋白酶活力的影響

2.2.3 殼聚糖濃度對(duì)固定化酶活力的影響 由圖4 可以看出,殼聚糖濃度為3%時(shí),固定化酶回收率最高。當(dāng)殼聚糖濃度大于3%時(shí),固定化酶回收率開始下降,原因是過大的殼聚糖濃度,使得微膠囊表面的聚電解質(zhì)膜,更加致密,造成底物擴(kuò)散困難、固定化酶活力回收降低,而且殼聚糖濃度過高形成的膠囊不易洗滌分離[7]。所以殼聚糖的濃度應(yīng)該選擇在3%。

圖4 殼聚糖濃度對(duì)固定化胃蛋白酶活力的影響

2.2.4 鈣離子濃度對(duì)固定化酶活力的影響 CaCl2與海藻酸鈉反應(yīng)形成海藻酸鈣凝膠是固定化酶的重要過程,CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)形成凝膠的機(jī)械強(qiáng)度有重要影響[8]。由圖5可以看出,低于3%時(shí),隨著鈣離子濃度增大,酶活力回收率逐漸增大；當(dāng)大于3%時(shí),隨著鈣離子濃度的增大,固定化酶回收率逐漸下降。主要原因是當(dāng)鈣離子濃度增大時(shí),較多的鈣離子會(huì)附著在固定酶微球的凝膠表面,影響了固定化酶的活力。

圖5 鈣離子濃度對(duì)固定化胃蛋白酶活力的影響

2.2.5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響 由圖6可知,交聯(lián)時(shí)間為4h時(shí),固定化酶活力回收率較高,固化時(shí)間在1～4h范圍內(nèi),由于海藻酸鈉-殼聚糖包埋逐漸緊密,酶流失量減小,固定化酶活力回收率逐漸增加；但當(dāng)時(shí)間超過4h后,回收率逐漸降低,原因在于固定化時(shí)間過長(zhǎng),海藻酸鈉鈣結(jié)構(gòu)過于致密,底物的擴(kuò)散阻力增加[9],酶活力降低,所以選用4h為最佳固定化時(shí)間。

圖6 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化胃蛋白酶活力的影響

通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Design Expert8.06響應(yīng)面設(shè)計(jì),以交聯(lián)時(shí)間(A)、海藻酸鈉濃度(B)、游離酶稀釋倍數(shù)(C)、氯化鈣濃度(D)、殼聚糖濃度(E)為自變量,固定化酶酶活回收率(R1)為響應(yīng)面值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

利用 Design Expert 8.06軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3(p值<0.05 為顯著項(xiàng))通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到酶活回收率(R1)對(duì)交聯(lián)時(shí)間(A)、海藻酸鈉濃度(B)、游離酶稀釋倍數(shù)(C)、氯化鈣濃度(D)、殼聚糖濃度(E)的回歸方程為:

R1=74.46-0.48A-0.35B+0.55C-0.034D-0.32E+0.97AB-0.26AC+1.65AD+0.59AE+2.40BC-2.29BD-0.19BE+1.37CD+0.16CE+0.15DE-0.63A2-1.81B2-0.42C2-1.67D2-0.57E2

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

應(yīng)用Design Expert 8.06進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析,得到最優(yōu)響應(yīng)面結(jié)果為交聯(lián)時(shí)間4h,海藻酸鈉濃度為3.40%,游離酶稀釋倍數(shù)為20倍,鈣離子濃度為3.64%,殼聚糖濃度為3.39%,固定化酶活回收率為74.87%±1.07%。

各兩因素交互作用(顯著項(xiàng))對(duì)固定化酶活回收率影響的響應(yīng)面圖見圖7。

圖7 各兩因素交互作用影響(顯著項(xiàng)) 對(duì)固定化效果影響的響應(yīng)面圖

固定C、D、E三因素到零水平,交聯(lián)時(shí)間(A)和海藻酸鈉濃度(B)有顯著交互作用,由圖7知,在不同海藻酸鈉濃度條件下,在一定范圍內(nèi),隨著交聯(lián)時(shí)間增大,固定化酶回收率減小；在不同交聯(lián)時(shí)間的條件下,在一定范圍內(nèi),隨著海藻酸鈉濃度的增加,固定化酶回收率先增加后減小。

氣象災(zāi)害來臨之際，因氣象部門或地方政府錯(cuò)誤估計(jì)了災(zāi)害天氣的嚴(yán)重程度，或者沒有做好災(zāi)害防御工作，災(zāi)后救援工作不及時(shí)等，最后導(dǎo)致防災(zāi)減災(zāi)工作沒有達(dá)到預(yù)期效果，嚴(yán)重威脅到了社會(huì)公共安全和人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)安全。

固定B、C、E三因素到零水平,交聯(lián)時(shí)間(A)和鈣離子濃度(D)有顯著交互作用,由圖7知,在不同鈣離子濃度條件下,在一定范圍內(nèi),隨著交聯(lián)時(shí)間增大,固定化酶回收率減小；在不同交聯(lián)時(shí)間的條件下,在一定范圍內(nèi),隨著鈣離子濃度的增加,固定化酶回收率減小。

固定B、C、D三因素到零水平,交聯(lián)時(shí)間(A)和殼聚糖濃度(E)有顯著交互作用,由圖7知,在不同殼聚糖濃度條件下,在一定范圍內(nèi),隨著交聯(lián)時(shí)間增大,固定化酶回收率先保持不變后減小；在不同交聯(lián)時(shí)間的條件下,在一定范圍內(nèi),隨著殼聚糖濃度的增加,固定化酶回收率先不變后減小。

固定A、D、E三因素到零水平,海藻酸鈉濃度(B)和游離酶稀釋倍數(shù)(C)有顯著交互作用,由圖7知,在不同游離酶稀釋倍數(shù)條件下,在一定范圍內(nèi),隨著海藻酸鈉濃度增大,固定化酶回收率先增大后減小；在不同海藻酸鈉濃度的條件下,在一定范圍內(nèi),隨著游離酶稀釋倍數(shù)的增加,固定化酶回收率先增大減小。

固定A、C、E三因素到零水平,海藻酸鈉濃度(B)和鈣離子濃度(D)有顯著交互作用,由圖7知,在不同鈣離子濃度條件下,在一定范圍內(nèi),隨著海藻酸鈉增大,固定化酶回收率先增大后減小；在不同海藻酸鈉的條件下,在一定范圍內(nèi),隨著鈣離子濃度的增加,固定化酶回收率先增大后保持不變。

固定A、B、E三因素到零水平,游離酶稀釋倍數(shù)(C)和鈣離子濃度(D)有顯著交互作用,由圖7知,在不同鈣離子濃度條件下,在一定范圍內(nèi),隨著游離酶稀釋倍數(shù)的增大,固定化酶回收率逐漸減小；在不同游離酶稀釋倍數(shù)的條件下,在一定范圍內(nèi),隨著鈣離子濃度的增加,固定化酶回收率先保持不變后減小。

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下,即交聯(lián)時(shí)間4h,海藻酸鈉濃度為3.40%,游離酶稀釋倍數(shù)為20倍,鈣離子濃度為3.64%,殼聚糖濃度為3.39%,進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)(3次),3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值為75.02%。響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好,說明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)際固定化效果。

2.4.1 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定比較 結(jié)果如圖8所示,游離酶的最適溫度為37℃,固定化酶的最適溫度為47℃,可見固定化后酶的耐熱性有所提高。結(jié)果表明酶經(jīng)固定化后最適溫度有所提高,可能由于固定化過程中酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,同時(shí)載體對(duì)酶也有一定保護(hù)作用[10]。

圖8 不同溫度時(shí)游離酶和固定化酶的相對(duì)酶活力

2.4.2 pH對(duì)固定化酶和游離酶酶活力的影響 由圖9可知,當(dāng)pH為2.0時(shí),游離酶達(dá)到最適pH,而固定化酶的最適pH為3.5,表明固定化后的胃蛋白酶的最適pH適應(yīng)范圍更加寬泛。

圖9 不同pH時(shí)游離酶和固定化酶的相對(duì)酶活力

2.4.3 固定化胃蛋白酶的操作穩(wěn)定性 由于固定化酶可以重復(fù)使用,所以測(cè)定相同條件下,重復(fù)使用5次后固定化酶的相對(duì)酶活力,以第一次測(cè)得的酶活力為100%,結(jié)果如圖10。

圖10 固定化酶的操作穩(wěn)定性

由圖10結(jié)果可知,重復(fù)5次以后,酶活力降為原來的 62.3%,相對(duì)活力的下降可能是由于在不斷攪拌的作用下,海藻酸鈉-殼聚糖載體持水性發(fā)生變化,酶的作用點(diǎn)隨著水解酪蛋白的不斷進(jìn)行而逐漸暴露,以及固定化酶凝膠結(jié)構(gòu)的改變所造成的結(jié)果。

3 結(jié)論

研究表明,海藻酸鈉-殼聚糖作為載體固定化胃蛋白酶的方法,具有工藝簡(jiǎn)單、條件溫和及操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn),且固定化作用的效果很好。得到的最佳固定化條件為：游離酶稀釋倍數(shù)為20倍,海藻酸鈉濃度為3.40%,殼聚糖濃度為3.39%,鈣離子濃度3.64%,時(shí)間為4h,固定化酶回收率74.87%,此種方法固定的胃蛋白酶的最適溫度為47℃,比游離酶升高了10℃；最適pH 為3.5與游離酶相比pH向堿性偏移1.5,固定化酶活力回收率為 74.87%；經(jīng) 5次循環(huán)重復(fù)使用后,固定化酶活力降為原來的62.31%,說明殼聚糖-海藻酸鈉作為載體固定的胃蛋白酶的穩(wěn)定性比較好。

[1]李彥峰,李軍榮,伏蓮娣.固定化酶的制備及應(yīng)用[J].高分子通報(bào),2001(2):13-23.

[2]吳國(guó)杰,李金蔓,崔英德，等. 海藻酸鈉-殼聚糖固定化載體的制備及應(yīng)用研究[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,20(4):1-5.

[3]Won,Kim S,Kim K,etal. Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads[J].Process Biochemisty,2005,40(6):2149-2154.

[4]曾嘉,鄭連英.殼聚糖微球固定化葡萄糖氧化酶的研究[J].食品工業(yè)科技,2002,23(1):29-31.

[5]海洪.殼聚糖固定化胃蛋白酶的研究[J].桂林工學(xué)院學(xué)報(bào),2003,23(3):331-333.

[6]楊勇,李彥鋒,拜永孝,等. 酶固定化技術(shù)用載體材料的研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)通報(bào),2007(4):257-263.

[7]張佳寧,宋云花,王玥,等.殼聚糖-海藻酸鈉固定化磷脂酶A2的研究[J].化學(xué)通報(bào),2012(7):201-205.

[8]王勝男,江連洲,李楊,等.海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶及酶活性質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技，2012(17):166-170.

[9]Ma J F,Zhang L H,Liang Z.Immobilized enzyme reactors in proteomics[J]. Trends in Analytical Chemistry,2011,30:691-702.

[10]黃峰華,于澤源,李興國(guó). 寒地特色中小蘋果果汁加工酶處理技術(shù)研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(3):277-279.

[11]高尚欣,周冰如,周錦絲,等. 海藻酸鈉-殼聚糖共固定化菠蘿莖蛋白酶的研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(5)209-211.

The study of pepsin immobilized with alginate and chitosa

LIXiao-jing1,HOUJun-cai1,*,JIANGLian-zhou1,ZHUXiu-qing2,HANZong-yuan1,WUYao1,ZHANGJia-xiu1,GAOMeng-ni1,HANWei-wei1,CAOQiu-ge1,GENGHao1

(1. College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2. National Research Soybean Engineering and Technology Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The pepsin was immobilized with the alginate and chitosan to crosslink. The enzymatic properties of the immobilized and free pepsin were studied to get the optimal parameters. The results showed that the optimal immobilization conditions were:the concentration of sodium alginate 3.40%,concentration of chitosan sugar 3.39%,concentration of CaCl23.64%,dilution fold of the free enzyme 20-fold,crosslinking time 4h,respectively. The recovery of the immobilized enzyme could reach 74.87%±1.07% at the optimum temperature of the immobilized enzyme 47℃ and optimum pH3.5,which obtained the operational and thermodynamic stability of the immobilized enzyme stability well. In addition,the immobilized enzyme activity after repeated use five times could still be maintained more than 62%.

alginat;chitosan;pepsin;immobilized enzyme

2013-06-25 *通訊聯(lián)系人

李曉靜(1987-),女,在讀碩士研究生,研究方向：食品科學(xué)與工程。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題項(xiàng)目(2012BAD34B04)資助。

TS201.1

：A

：1002-0306(2014)01-0168-06