單增李斯特菌非可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)與PMA-qPCR檢測(cè)

,,秀麗，,，*,

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640； 2.廣東省惠州市質(zhì)量計(jì)算監(jiān)督檢測(cè)所，廣東惠州 516000))

單增李斯特菌非可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)與PMA-qPCR檢測(cè)

黃韻1,余以剛1,黃秀麗2，李曉鳳1,肖性龍1，*,吳暉1

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640； 2.廣東省惠州市質(zhì)量計(jì)算監(jiān)督檢測(cè)所，廣東惠州 516000))

在9%(w/v)NaCl條件下,通過(guò)溫度、pH兩種因素誘導(dǎo)一株單增李斯特菌進(jìn)入“活的非可培養(yǎng)”(viable but non-cuturable,VBNC)狀態(tài)。通過(guò)LIVE/DEAD Baclight活菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)與活菌數(shù),比較單增李斯特菌狀態(tài)及數(shù)量的差異與變化。結(jié)果顯示,在2℃、pH6.0條件下單增李斯特菌活菌全部進(jìn)入VBNC狀態(tài)。用PMA-qPCR對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)的四份菌液進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明該方法能快速、準(zhǔn)確地測(cè)出死菌背景下的活的單增李斯特菌。

VBNC,PMA,單增李斯特菌,活菌,檢測(cè)

單增李斯特菌是一種食源性致病菌,常見(jiàn)于海鮮、生肉、鮮奶等食物中,食用被該菌污染的食物后能引起食物中毒,引發(fā)李斯特菌病。單增李斯特菌能在0.5～45℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng),在pH4.7～9.2、高滲透壓條件下仍能繁殖[1]。Bajard等[2]驗(yàn)證單增李斯特菌在-2℃仍能在肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。因此,在低溫條件下仍能保持繁殖的單增李斯特菌對(duì)冷鮮、冷藏食品等構(gòu)成重大威脅。至今已有60多種細(xì)菌被證實(shí)可進(jìn)入VBNC狀態(tài)[3]。VBNC狀態(tài)的細(xì)菌具有代謝活性,但無(wú)法在常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。這是細(xì)菌面臨生存威脅時(shí)的一種生存策略[4],而在特定條件下,VBNC菌能恢復(fù)繁殖能力及毒性[5]。因此,雖然VBNC狀態(tài)的致病菌不具有繁殖能力,但仍對(duì)人類(lèi)健康具有潛在危害。已知能誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的因素很多[6-10],Besnard等[11]利用自然環(huán)境的水,通過(guò)調(diào)節(jié)菌種量、溫度、pH、鹽度、光照等因素,誘導(dǎo)出VBNC狀態(tài)的單增李斯特菌,并用CTC-DAPI法、DVC法驗(yàn)證。Dreux等[12]利用低相對(duì)濕度在香菜葉上誘導(dǎo)出VBNC狀態(tài)的單增李斯特菌,Cunningham等[13]利用食品防腐劑誘導(dǎo)單增李斯特菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。隨著細(xì)菌VBNC狀態(tài)概念的提出與證實(shí),傳統(tǒng)方法已不能滿(mǎn)足人們對(duì)細(xì)菌(尤其是致病菌)的檢測(cè)需求。PMA-qPCR技術(shù)是近年新興的活菌檢測(cè)技術(shù),由Nogva等[14]最先提出。其原理是利用PMA滲入受損細(xì)胞膜與DNA結(jié)合,通過(guò)抑制DNA在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增達(dá)到區(qū)分死、活菌檢測(cè)的目的。本研究主要通過(guò)利用NaCl濃度、pH、溫度幾個(gè)因素誘導(dǎo)單增李斯特菌進(jìn)入VBNC狀態(tài),并嘗試運(yùn)用PMA-qPCR技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證該方法對(duì)單增李斯特菌活菌定量檢測(cè)的適用性。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用菌株為單增李斯特菌(CMCC34761),為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。細(xì)菌培養(yǎng)采用腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L,脫水小牛腦浸粉12.5g/L,脫水牛心浸粉5g/L,氯化鈉5g/L,葡萄糖2g/L,磷酸氫二鈉2.5g/L),pH7.4±0.2。培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)121℃,20min滅菌后使用。將細(xì)菌分別接種到30mL BHI液體培養(yǎng)基中于37℃下180r/min搖床中過(guò)夜培養(yǎng)20h(OD600≈1)。采用含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)培養(yǎng)基(胰胨17g/L,多價(jià)胨3g/L,酵母膏6g/L,氯化鈉5g/L,磷酸氫二鉀2.5g/L,葡萄糖2.5g/L,瓊脂15g/L,pH 7.2～7.4)作為固體培養(yǎng)基,121℃,20min滅菌后使用,用于平板法測(cè)可培養(yǎng)菌數(shù)。

所用試劑均為化學(xué)純或分析純；LIVE/DEAD? BacLightTMBacterial Viability Kit購(gòu)自 Life Technologies公司(美國(guó))；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒 購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；PCR Amplification Kit 購(gòu)自TaKaRa公司。

SPX-250B生化培養(yǎng)箱,高壓蒸汽滅菌鍋 購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；水浴鍋 購(gòu)自雷蒙特實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；ESCO生物安全柜 購(gòu)自浩瀚有限公司；ABI7500熒光定量PCR儀器 購(gòu)自應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(美國(guó))；鹵鎢燈(650W) 購(gòu)自 Osram公司(德國(guó))；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 購(gòu)自Eppendorf公司(德國(guó))；多微孔板檢測(cè)器Victor3 V 1420 multilabel counter 購(gòu)自Perkin Elmer公司(美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VBNC狀態(tài)的單增李斯特菌的誘導(dǎo) 取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)平臺(tái)期的單增李斯特菌菌液30mL于50mL無(wú)菌離心管中,9000r/min離心5min,棄上清。用20mL無(wú)菌去離子水重懸洗滌菌體三次后,以9% NaCl(w/v)溶液(無(wú)菌)重懸于1L錐形瓶。調(diào)整細(xì)菌濃度為1.8×107CFU/mL,最終菌液體積為500mL。分別調(diào)節(jié)pH為6.0或7.0(0.1mol/L HCl),分別在2、25℃溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)過(guò)程中利用平板計(jì)數(shù)法觀察細(xì)菌可培養(yǎng)數(shù)的變化。由于低氯化鈉濃度對(duì)誘導(dǎo)單增李斯特菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)具有積極作用,能縮短細(xì)菌失去可培養(yǎng)性所需的時(shí)間[11],因此實(shí)驗(yàn)中四個(gè)誘導(dǎo)液均使用含有9% NaCl(w/v)的無(wú)菌水。

為測(cè)定細(xì)菌可培養(yǎng)數(shù),每次取1mL誘導(dǎo)菌液進(jìn)行梯度稀釋,吸取100μL稀釋液涂布于TSA-YE固體培養(yǎng)基上,每個(gè)濃度設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn),37℃下培養(yǎng)48h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。在誘導(dǎo)期,當(dāng)上述方法無(wú)菌落檢出時(shí),為確認(rèn)菌液中是否仍存在可培養(yǎng)細(xì)菌,取10mL菌液于無(wú)菌離心管中,9000r/min離心5min后用1mL無(wú)菌去離子水重懸,并取100μL涂布于TSA-YE固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后觀察。當(dāng)連續(xù)三天平板上無(wú)菌落長(zhǎng)出時(shí),確認(rèn)細(xì)菌失去可培養(yǎng)性。

1.2.2 細(xì)菌總數(shù)與活菌數(shù)量的測(cè)定 細(xì)菌總數(shù)及活菌數(shù)使用LIVE/DEAD? BacLight Bacterial Viability Kit按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量測(cè)定,通過(guò)多微孔板檢測(cè)器收集熒光強(qiáng)度。死菌數(shù)、VBNC菌數(shù)計(jì)算公式如下,數(shù)值均采用三次平行實(shí)驗(yàn)所得的平均數(shù)(單位以CFU/mL記,細(xì)菌可培養(yǎng)數(shù)通過(guò)平板計(jì)算法測(cè)定)：

死菌數(shù)=細(xì)菌總數(shù)-活菌數(shù)

不可培養(yǎng)活菌數(shù)=活菌數(shù)-可培養(yǎng)菌數(shù)

1.2.3 PMA-qPCR檢測(cè) 誘導(dǎo)期結(jié)束后,利用熒光定量PCR檢測(cè)熱滅活的死菌以及新鮮培養(yǎng)的單增李斯特菌的細(xì)菌總數(shù)。通過(guò)使用PMA-qPCR技術(shù)檢測(cè)以上各種菌液中的活菌數(shù)。死菌采用熱滅活方法制備,取1mL新鮮的單增李斯特菌菌液,用無(wú)菌水洗滌兩次后重懸,調(diào)整菌濃度為1.8×107CFU/mL(與誘導(dǎo)液起始濃度一致),于沸水浴中處理2min后取出,并以平板計(jì)數(shù)法確認(rèn)無(wú)菌落產(chǎn)生。另取1mL新鮮菌液,經(jīng)兩次無(wú)菌水洗滌后重懸,同樣調(diào)整細(xì)菌濃度為1.8×107CFU/mL,即為活菌樣本。

1.2.3.1 PMA處理 分別取500μL四種誘導(dǎo)的單增李斯特菌、熱滅活的死菌及活菌的菌液于1.5mL離心管中,9000r/min離心3min,等體積無(wú)菌水重懸。菌液中加入5mg/mL的PMA儲(chǔ)備液1μL使菌液中PMA終濃度為10μg/mL,充分混勻后,于室溫下暗處孵育10min。將離心管水平放置于冰上,于鹵鎢燈下方20cm處進(jìn)行5min光照,期間輕輕搖晃冰盒保證溶液得到充分照射。

1.2.3.2 DNA提取以及熒光定量PCR檢測(cè) 取500μL經(jīng)過(guò)PMA處理和未經(jīng)過(guò)PMA處理的各誘導(dǎo)菌液于1.5mL無(wú)菌離心管中,9000r/min離心5min,按照細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明操作提取基因組DNA,作為定量PCR反應(yīng)模板。用DNAStar Seqman模塊(DNASTAR,Inc)對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行基因序列比對(duì)、用Primer Express 2.0(Applied Biosystems)設(shè)計(jì)引物和探針。

上游引物5′-TTC ATC CAT GGC ACC ACC A-3′,

下游引物5′-TAT ACT TAT CGA TTT CAT CCG CGT GT-3′,

探針FAM-5′-CCG CCT GCA AGT CCT AAG ACG CCA-3′-BHQ1。

熒光定量PCR反應(yīng)體系為25μL,其中含10×(NH4)2SO4緩沖液2.5μL,25mmol/L Mg2+溶液3.5μL,25mmol/L,dNTPs 1μL,15μmol/L前后引物各1μL,10μmol/L探針1μL,模板溶液2μL,Taq DNA聚合酶2.5U,DEPC水12.5μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min；95℃變性5s,60℃、40s(收集熒光信號(hào)),共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后40℃保溫2min。每個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)各三次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算平均Ct值和樣本標(biāo)準(zhǔn)差SD值。

2 結(jié)果與討論

2.1誘導(dǎo)條件的影響

圖1a～圖1d分別給出了在2℃、pH6.0,2℃、pH7.0,25℃、pH6.0及25℃、pH7.0四種不同誘導(dǎo)條件下,誘導(dǎo)期細(xì)菌總數(shù)、活菌數(shù)、細(xì)菌可培養(yǎng)數(shù)、不可培養(yǎng)活菌數(shù)及死菌含量的變化。如圖所示,在誘導(dǎo)過(guò)程中,通過(guò)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)菌可培養(yǎng)數(shù),除圖1b(2℃,pH6.0條件)的樣本的可培養(yǎng)菌數(shù)降為0(90d后)外,圖1a、圖1c、圖1d的可培養(yǎng)菌數(shù)在100d誘導(dǎo)期結(jié)束后分別為4.3×106、3.3×106、9.3×105CFU/mL左右。

2.2誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)菌狀態(tài)與數(shù)量的變化

LIVE/DEAD活菌檢測(cè)試劑盒曾被Boulos等[15]用于檢測(cè)飲用水中的活菌數(shù)與細(xì)菌總數(shù)。LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測(cè)試劑盒中含有兩種核酸染料：SYTO9及PPI(碘化丙啶)。SYTO9染料能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,與DNA結(jié)合后發(fā)出綠色熒光。PPI不具有細(xì)胞膜穿透性,通過(guò)滲入膜損傷細(xì)胞與DNA結(jié)合,發(fā)出紅色熒光,而在PPI與SYTO9同時(shí)結(jié)合細(xì)胞DNA的情況下,細(xì)胞發(fā)出紅色熒光[16]。因此,經(jīng)試劑盒染料處理后的菌液,其總菌數(shù)為紅色熒光細(xì)胞與綠色熒光細(xì)胞之和,活菌數(shù)為發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞總數(shù)。

如圖1所示,誘導(dǎo)期結(jié)束后,圖1b 2℃,pH6.0的誘導(dǎo)液中,其細(xì)菌可培養(yǎng)菌數(shù)降為0,而活菌數(shù)為1.4×107CFU/mL,說(shuō)明誘導(dǎo)液中所有的單增李斯特菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。其他三種誘導(dǎo)液中,活菌檢出量分別為1.6×107、7.2×106、5.2×106CFU/mL(依次為圖1a、圖1c、圖1d),而可培養(yǎng)數(shù)為4.3×106、3.3×106、9.3×105CFU/mL(依次為圖1a、圖1c、圖1d),活菌檢出量遠(yuǎn)大于檢出的可培養(yǎng)菌數(shù),說(shuō)明三種含有可培養(yǎng)細(xì)菌的菌液中,除了可培養(yǎng)出的細(xì)菌外,還含有另一部分無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)法檢出的活菌,即VBNC菌。由于四種誘導(dǎo)液中的VBNC菌數(shù)量分別為1.2×107、1.4×107、3.9×106、4.3×106CFU/mL(依次為圖1a、圖1b、圖1c和圖1d)。與25℃相比,2℃下有更多的細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。這可能是相對(duì)于常溫來(lái)說(shuō),2℃低溫使細(xì)菌面臨更大的生存壓力,因?yàn)檫M(jìn)入VBNC狀態(tài)是細(xì)菌應(yīng)對(duì)外部不利條件時(shí)的一種生存策略[4]。然而,在誘導(dǎo)過(guò)程中,在控制溫度和pH兩個(gè)單一變量的四種情況下,只有在2℃、pH6.0的條件下單增李斯特菌大量、全部進(jìn)入VBNC狀態(tài),說(shuō)明單一因素的刺激不足以對(duì)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)有決定性的影響,VBNC菌的形成可能更多的取決于溫度、pH、低濃度氯化鈉以及營(yíng)養(yǎng)缺乏等各種因素的共同作用。此外,細(xì)菌的菌株不同對(duì)誘導(dǎo)條件的響應(yīng)也不盡相同,如Vattakaven等[17]對(duì)溶珊瑚弧菌進(jìn)行VBNC誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn),不同來(lái)源的同種細(xì)菌,進(jìn)入VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)條件及VBNC狀態(tài)的菌數(shù)會(huì)有差異,而同種細(xì)菌不同菌株間對(duì)誘導(dǎo)條件的響應(yīng)也不盡相同甚至相反[11]。因此細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的成因復(fù)雜,至今未有明確的定論。

此外,相對(duì)于25℃誘導(dǎo)的菌液,2℃下誘導(dǎo)的菌液中活菌含量更高,說(shuō)明低溫對(duì)提高細(xì)菌的存活率有較大影響,可能是因?yàn)槿芤褐泻?% NaCl(w/v),而低溫降低了細(xì)胞內(nèi)部新陳代謝和能量轉(zhuǎn)換的速度,從而延遲了細(xì)胞的損傷。但溫度相同的條件下,pH對(duì)活菌水平僅有輕微影響。

2.3單增李斯特菌的PMA-qPCR檢測(cè)

利用LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測(cè)試劑盒可快速檢測(cè)樣本的總菌數(shù)和活菌數(shù),然而對(duì)于未知樣本,LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測(cè)試劑盒無(wú)法對(duì)其中含有的細(xì)菌種類(lèi)進(jìn)行鑒別。而熒光定量PCR技術(shù)可檢測(cè)出樣本中的總菌數(shù),但不能對(duì)死菌與活菌含量進(jìn)行區(qū)別檢測(cè)。PMA-qPCR聯(lián)用技術(shù)是近年來(lái)快速發(fā)展的新型活菌檢測(cè)技術(shù),它克服了定量PCR技術(shù)的不足,利用PMA滲入膜損傷細(xì)胞,與DNA共價(jià)結(jié)合,從而抑制膜損傷細(xì)胞DNA在PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中的活菌進(jìn)行快速的定性與定量檢測(cè)[18]。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 取新鮮培養(yǎng)、菌濃度為2.3×109CFU/mL(平板計(jì)數(shù)法檢測(cè))的單增李斯特菌活菌液,使用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA后,對(duì)DNA進(jìn)行0、10、100、1000、10000倍的梯度濃度稀釋。稀釋后的DNA作為熒光定量PCR反應(yīng)模板制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)。

圖2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 PMA-qPCR檢測(cè) 對(duì)經(jīng)過(guò)PMA處理以及未經(jīng)過(guò)PMA處理的四種誘導(dǎo)的單增李斯特菌、活的單增李斯特菌及死菌經(jīng)進(jìn)行DNA提取,得到的DNA作為熒光定量PCR反應(yīng)模板。各樣本中的細(xì)菌總數(shù)及活菌數(shù)如圖3所示。

圖3 qPCR和PMA-qPCR檢測(cè) 不同條件下的單增李斯特菌

從圖3可知,經(jīng)過(guò)PMA處理和未經(jīng)PMA處理的單增李斯特菌活菌的qPCR反應(yīng)結(jié)果得出的細(xì)菌總數(shù)、活菌數(shù)都與實(shí)際值很接近(1.8×107CFU/mL,log(CFU/mL)約為7.26)。而未經(jīng)PMA處理的死菌,檢出的總菌數(shù)與活菌樣本一致,但其活菌數(shù)無(wú)法檢出,說(shuō)明PMA可以有效抑制死菌DNA擴(kuò)增,將PMA與qPCR結(jié)合起來(lái)的檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確地對(duì)樣本總菌數(shù)和活菌數(shù)進(jìn)行區(qū)別檢測(cè)。從圖3可見(jiàn),四個(gè)誘導(dǎo)液樣本中的細(xì)菌總數(shù)與活菌、死菌中的細(xì)菌總數(shù)接近,說(shuō)明單增李斯特菌在經(jīng)歷誘導(dǎo)后,菌液濃度并未發(fā)生較大變化,這與LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測(cè)試劑盒的結(jié)果是一致的。除此以外,通過(guò)PMA-qPCR方法檢出的四種誘導(dǎo)液中的活菌含量與LIVE/DEAD? BacLight活菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的活菌含量也接近,說(shuō)明PMA-qPCR法能在混合樣本中對(duì)活菌進(jìn)行有效、準(zhǔn)確的定量。

3 結(jié)論

通過(guò)比較與考察兩種溫度、pH對(duì)誘導(dǎo)一株單增李斯特菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的作用,發(fā)現(xiàn)在缺營(yíng)養(yǎng)、9%(w/v)NaCl,2℃,pH6.0的條件下可以成功誘導(dǎo)單增李斯特菌進(jìn)入VBNC狀態(tài),其中低溫是成功誘導(dǎo)的重要條件。PMA-qPCR作為新型活菌檢測(cè)技術(shù),可以有效、準(zhǔn)確地區(qū)分活的單增李斯特菌,在含有死菌的背景下實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌的快速定量檢測(cè)。該方法克服了傳統(tǒng)qPCR法假陽(yáng)性的缺點(diǎn),能有效識(shí)別活菌(包括VBNC菌),為致病菌活菌檢測(cè)提供新的方向。

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Induction and PMA-qPCR detection ofListeriamonocytogenesin viable but non-culturable state

HUANGYun1,YUYi-gang1,HUANGXin-li2,LIXiao-feng1,XIAOXing-long1,*,WUHui1

(1.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.Huizhou Quanlity and Measuring Superrision Testing Intitute,Huizhou 516000,China)

Under the condition of 9%(w/v)NaCl,the induction of “viable but non culturable”(VBNC)Listeriamonocytogeneswas undertaken by investigating two factors,temperature and pH. In order to compare the changes of bacteria state and numbers caused by different inducing conditions,the LIVE/DEAD? BacLightTMBacterial Viability Kit was used for enumeration of total cells and viable cells. The results showed that all viableListeriamonocytogeneswere induced into the VBNC state at 2℃,pH6.0. PMA-qPCR was proposed to detect theListeriamonocytogenesexperienced different inductions. It was indicated that PMA-qPCR was an effective method to detect viableListeriamonocytogeneseven if undering the dead cells background.

VBNC;PMA;Listeriamonocytogenes;viable cells;detection

2013-07-11 *通訊聯(lián)系人

黃韻(1988-)，女，碩士，主要從事食品安全與檢測(cè)研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101279)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(31271867)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金新教師類(lèi)資助課題(20110172120034)；華南理工大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目(2013ZZ068)；惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(0031939140712048)；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011B020314004)；2013年華南理工大學(xué)百步梯攀登計(jì)劃項(xiàng)目資助(DC30913001)。

TS207.4

：A

：1002-0306(2014)01-0137-05