虎奶菇菌核多糖的溶液粘度及構象研究

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(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710062)

虎奶菇菌核多糖的溶液粘度及構象研究

劉阿娟,張靜*,張化朋,張鵬,梁濤,孫潤廣

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安 710062)

用剛果紅實驗和圓二色光譜觀察了不同條件下SHNP分子在溶液中的形貌特征,研究了不同溶液體系中虎奶菇菌核多糖SHNP的比濃粘度和粒度變化情況,以判斷其分子的溶液構象。研究表明：溫度、pH、變性劑、金屬離子等外界條件均不同程度的影響SHNP溶液的比濃粘度；在pH為12時,SHNP聚集體的有效直徑呈現最大化；剛果紅實驗和圓二色光譜分析表明,SHNP不具有三股螺旋結構,以無規線團鏈構象存在,pH、變性劑均可改變其構象。

多糖,構象,比濃粘度,圓二色光譜

虎奶菇,又稱虎奶菌、核耳菇、茯苓側耳、南洋茯苓等,學名菌核側耳或地核側(Pleurotus tuber-regium),為擔子菌綱口蘑科側耳屬真菌,是一種珍稀食藥用真菌,甘溫,補氣益血,治氣血虛弱癥[1],主要分布在我國云南省的騰沖和章鳳等地,以及馬來西亞、澳大利亞、尼日利亞和肯尼亞等,其中多糖是虎奶菇主要的活性成分,研究表明虎奶菇菌核多糖具有很好的抗腫瘤[2]、降血糖[3]、抗氧化[3]、降血脂[4]和抗病毒[5]活性,并有細胞的凝集作用[6],以及增強免疫力[7-8]等生物活性。多糖的生物活性主要取決于其理化性質、一級結構、高級結構和立體構型等[9-13],多糖生物活性與溶液的環境密切相關,因此多糖在不同溶液中的行為和分子鏈構象在活性發揮與構效關系上有著非常重要的生物學意義,值得深入研究。本文對熱水提取的虎奶菇菌核多糖進行了分離純化,通過剛果紅實驗、圓二色光譜(CD)、粘度法(Vis)研究了虎奶菇菌核多糖的溶液行為及構象[14-15],為虎奶菇多糖的構效關系研究提供了實驗依據,具有重要的理論參考價值。

1. 材料與方法

1.1材料與設備

虎奶菇菌核多糖 本實驗室提取制備；化學試劑均為分析純。

HH-SA型恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;Alphal-4型真空冷凍干燥機 德國CHRIST公司;烏氏粘度計 上海玻璃儀器一廠;JB-3型定時恒溫磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司;激光粒度儀 美國布魯克海文公司；圓二色譜儀 英國應用光物理公司。

1.2實驗方法

1.2.1 虎奶菇菌核多糖的分離純化 虎奶菇菌核粉碎、過60目篩,50℃烘干,95%乙醇脫脂,再置于50℃烘箱中烘干去除殘留的乙醇,冷卻至室溫得到干燥的脫脂虎奶菇菌核粉。將其與蒸餾水以1∶30的固液比混合,在100℃下浸提2h,浸提2次,離心去上清液,透析,冷凍干燥得到棕色虎奶菇菌核粗多糖(HNP)。

稱取200mg HNP,溶解于少許蒸餾水中,離心去除不溶物質后,將離心后的溶液上樣于DEAE一52纖維素陰離子交換柱(2.5cm×80cm),洗脫液依次為：蒸餾水、0.05mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl,流速為每管600s,每管收集8mL左右,初步分級的組分依次命名為：WHNP、SHNP、SHNP1、SHNP2,分別依次按苯酚硫酸法[16]測每管的吸光值,合并單一峰組分,其中SHNP得率為最多。實驗以含量最多的SHNP作為后期的研究目標,進而將其收集、透析、真空冷凍干燥以備后用。

稱取100mg SHNP,溶于少許蒸餾水中,再離心,上清液上樣于葡萄糖凝膠G-150(SephadexG-150),以蒸餾水為洗脫液,進一步分離純化,流速為每管450s,每管收集3mL,進行苯酚硫酸法測定吸光值,合并單一峰組分,收集冷凍干燥,即得虎奶菇菌核多糖SHNP純品。

1.3.2 純度鑒定及單糖組成分析 對上述純化后的SHNP進行紫外分光光度計檢測;用高效液相色譜儀進行純度鑒定及分子量測定：配制1mg/mL的上述糖液,20μL進樣。采用氣相色譜法進行單糖組分分析,按照文獻[17]制備糖腈乙酰化衍生物以備氣相色譜分析,進樣量為0.1μL,通過樣品的保留時間與標準品的保留時間相比較,確定SHNP的單糖組成。

1.3.3 溶液粘度的測定 對文獻[18-19]的方法稍加改進,用烏氏粘度計測定不同溫度、不同濃度、不同pH下SHNP的比濃粘度。依次配濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL的MgCl2、KCl、NaCl、CaCl2溶液以及濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的脲溶液測定SHNP溶液的比濃粘度。用烏氏粘度計在25℃測定SHNP的比濃粘度(ηsp)。

ηsp=(η/η0-1)/C

式中：η：待測溶液的粘度(mpa.s)；η0:2 0℃蒸餾水的粘度(mpa.s)；C:待測溶液的濃度(mg/mL)；ηsp：待測溶液的比濃粘度。

1.3.4 剛果紅實驗 配制2mg/mL的SHNP溶液,取2.0mL與等體積80μmol/L剛果紅溶液均勻混合,依次加入不同體積的濃度為4mol/L的NaOH,使得NaOH的濃度從0mol/L逐漸升至0.5mol/L,室溫下靜置15min,在400～600nm范圍內,用紫外可見分光光度計對其進行光譜掃描,記錄下該溶液在不同NaOH濃度下的最大吸收波長。以不加多糖的剛果紅溶液和NaOH各濃度的混合液做參比,以溶液中NaOH的濃度為橫坐標,溶液的最大吸收波長為縱坐標作圖[20]。

1.3.5 圓二色光譜(CD)測定 參照文獻[21]方法,用圓二色光譜儀測定圓二色譜。將SHNP配制成1.0mg/mL的溶液與剛果紅(80μmol/L)絡合后測定CD譜,檢測波長范圍180～400nm。

1.3.6 粒度分布測定 配制質量濃度分別為0.01mg/mL,pH2、7、12的SHNP溶液,于室溫下測其在635nm波長處粒度分布。觀察在不同pH下SHNP分子的粒度分布變化。

2 結果與討論

2.1 SHNP的純度鑒定及其單糖組成

紫外光譜掃描結果如圖1顯示：SHNP在200nm處有糖類物質的特征吸收峰,在260nm和280nm無特征吸收峰,判斷SHNP分子沒有核酸和蛋白質。經高效液相色譜(如圖2)分析,可以看到SHNP呈單一對稱峰,進一步表明SHNP是均一多糖單一組分,其分子量經計算為：1.463×106u。氣相色譜分析表明SHNP是只含葡萄糖的大分子葡聚糖,可用于進一步的結構分析和研究。

圖1 SHNP的紫外光譜掃描

圖2 SHNP的高效液相色譜圖

2.2溶液比濃粘度測定結果

2.2.1 溫度對SHNP溶液比濃粘度的影響 在不同的溫度下保溫30min后,測得的SHNP溶液比濃粘度見圖3。由圖3可知：溫度從25℃升至35℃,該多糖溶液比濃粘度增長急劇,這是由于溫度升高,使糖鏈活動能力增強,使其無規卷曲構象有所擴展,導致比濃粘度急劇增長,之后的35～65℃,隨著溫度的增高,溶液的比濃粘度下降。原因是熱力作用破壞了多糖分子側鏈間的氫鍵和離子鍵,使多糖的多聚體結構變為低聚體,聚合度的下降導致了比濃粘度下降,而在35℃升至40℃的過程中出現急劇減小的現象,說明這種熱力破壞作用在此溫度區間表現的更突出,在65～80℃時,SHNP的比濃粘度比較穩定,這說明在此溫度區間,溫度變化對其比濃粘度影響不大,多糖溶液在此溫度區間的耐熱性能比較好。

圖3 溫度對SHNP溶液比濃粘度的影響

2.2.2 濃度對SHNP溶液比濃粘度的影響 在25℃,將不同濃度的SHNP溶液恒溫30min,SHNP溶液比濃粘度結果見圖4。隨著濃度的增大,SHNP多糖的比濃粘度總體上逐淅增大,但在低濃度時(1～3mg/mL),濃度對其比濃粘度幾乎沒影響,濃度超過3mg/mL后,溶液的比濃粘度以較大的幅度增長。這是因為隨著溶液中主要的粘稠物質為高分子SHNP,隨著其含量的增加,多糖分子相互聯結、聚合的程度增加,溶液的比濃粘度越大,這種現象符合一般高分子溶液的粘度特性[22]。

圖4 濃度對SHNP溶液比濃粘度的影響

2.2.3 變性劑脲對SHNP溶液比濃粘度的影響 在SHNP溶液中加入不同濃度的脲,恒溫30min后,由圖5可知：脲濃度在0.1～0.4mg/mL范圍內,隨著濃度的增加,其比濃粘度呈減小趨勢,在0.4～0.6mg/mL濃度范圍內,其比濃粘度又呈現增加的態勢,之后隨著脲濃度的增加其比濃粘度又減小。即加入的變性劑量的不同對多糖分子構象的影響不同。這可能是變性劑在一定劑量下,會造成SHNP一些氫鍵斷裂,葡聚糖分子結構有所收縮或伸展,使其構象不穩定,導致溶液比濃粘度減小或增大[23]。

2.2.4 pH對SHNP溶液比濃粘度的影響 圖6可知,SHNP溶液在酸性及堿性條件下,其比濃粘度比中性條件下都有所下降,在酸性條件下其比濃粘度變化不大,但堿性條件變化更突出一些。這是由于氫離子和氫氧根離子對多糖的側鏈均有一定的破壞作用,氫氧根離子的作用更強些。因此酸、堿度的增加都會使多糖聚合度減小,從而降低了其比濃粘度,而在酸性條件下,其比粘度基本不變,說明了SHNP的構象在酸性條件下比較穩定。

圖5 脲對SHNP溶液比濃粘度的影響

圖6 pH對SHNP溶液比濃粘度的影響

2.2.5 金屬鹽離子對SHNP溶液比濃粘度的影響 圖7說明,不同濃度的Na+、Mg2+、Ca2+的存在均可使SHNP溶液的比濃粘度有不同程度的增加,K+對其比濃粘度幾乎沒影響。隨著Mg2+、Na+濃度的增加,其比濃粘度呈增長態勢,而Ca2+則在濃度為0.5mol/L時,多糖的比濃粘度達到最大。這可能由于多糖分子鏈中存在的羥基與某些金屬離子發生絡合作用,形成蛋箱結構[24],構象變化導致溶液比濃粘度增加；還可能是由于SHNP本身分子量很大,引起比濃粘度增大。

圖7 金屬離子對SHNP溶液比濃粘度的影響

2.3虎奶菇菌核多糖SHNP構象的初步判定

剛果紅實驗是研究多糖大分子構象的一種有效方法。剛果紅是一種酸性染料,可與具有三股螺旋構象的多糖形成配合物,其紫外最大吸收波長能使剛果紅本身紫外最大吸收波長發生紅移,且在一定的NaOH 濃度范圍內,配合物出現亞穩區即絡合物的紫外最大吸收波長急劇下降。實驗結果如圖8所示：NaOH濃度在0～0.5mol/L范圍內變化期間,WHNP與剛果紅形成的絡合物,其紫外最大吸收波長雖也發生紅移,但最大吸收波長增長的緩慢,并沒有發生急劇下降的現象,即未曾出現亞穩態區,這說明虎奶菇菌核多糖SHNP不具有三股螺旋結構[25]。與右旋糖酐無規線團鏈構象類似[26],說明SHNP在水溶液中以呈無規線團(random coil)鏈構象存在。

圖8 虎奶菇菌核多糖SHNP-剛果紅絡合物的 最大吸收波長變化

2.4圓二色光譜(CD)分析SHNP構象

2.4.1 Ca2+添加對SHNP多糖構象的影響 圓二色光譜(CD)是一種差光譜,是樣品在左右旋偏振光照射下的吸收光譜差值。由于生物大分子基本都含有手性的基團和結構,因此圓二色光譜可以幫助測量和觀察生物大分子的結構和構象變化,圓二色譜對構象變化很敏感,它可靈敏地檢測一些反應引起的構象變化,是研究多糖三維結構的有效方法之一。多糖的圓二色性與其分子的結構和構象存在一定關系。由圖9可知,Ca2+使得多糖溶液的圓二色譜正峰峰強度減弱,負峰強度增強,但各正負峰的最大吸收位置沒有變化,在191nm附近正峰的峰面積略有減小,揭示了由于鈣離子的參與,多糖分子間通過Ca2+橋鍵使多糖空間的手性減小,SHNP鏈變得較柔順,鏈的對稱性減小,但基本構象未發生改變[27]。

圖9 Ca2+處理的SHNP的圓二色譜

2.4.2 剛果紅對SHNP構象的影響 結果見圖10。剛果紅的加入使得多糖圖譜在192nm處正峰減弱,214nm處負峰也有所減弱,位置未發生改變,其它各處的峰值幾乎無任何變化,沒有發生Cotton效應,表明SHNP與剛果紅發生了絡合反應,但未能其形成有多股螺旋的特征絡合物,進一步也揭示了前面的剛果紅實驗。SHNP不存在具有多股螺旋的構象,以無規線團鏈構象存在于溶液中。

圖10 剛果紅處理的SHNP的圓二色譜

2.4.3 二甲基亞砜(DMSO)對SHNP多糖構象的影響 圓二色光譜圖(CD)顯示：DMSO的加入使其圖譜出現了突然一個高峰(或一個低谷)緊接著又一個低谷(或高峰)的Cotton效應[28-29]DMSO的入在很大程度上破壞了多糖分子內和分子間氫鍵相互作用,增加了多糖分子(C-O和O-H)的不對稱性,使得多糖分子的圓二色譜發生較大變化,揭示了DMSO的參與使得SHNP構象發生較大變化。

圖11 二甲基亞砜處理的SHNP的圓二色譜

2.4.4 pH對多糖構象的影響 圓二色譜圖(CD)顯示：在pH2時只是峰的強弱發生了稍許的變化,其他位置基本不變,而在pH12條件下,正峰強度顯著增強,負峰位置及強度也發生了變化,這很可能是由于堿性條件下使得分子間或分子內的氫鍵鍵和作用發生改變導致的,說明了SHNP多糖在酸性條件下結構相對穩定,而堿性條件可能會使其構象發生改變。

圖12 不同pH處理下SHNP的圓二色譜

2.5 SHNP的粒度分布分析

激光粒度分布測定結果顯示：不同pH下,SHNP粒度分布不同,SHNP多糖聚集體大小依次為：堿性>中性>酸性,其中在酸性與中性環境中的聚集體的有效直徑接近,說明酸性環境對此多糖分子間及分子內的相互作用影響比較小,而堿性環境影響較大,使其分子間或分子內的作用增強,使其構象結構發生變化,從而聚集作用比較顯著。

表1 不同pH時的粒度分布變化

3 結論

虎奶菇菌核多糖的比濃粘度,在溫度未達35℃之前,其隨溫度的升高而增大,超過35℃,比粘度隨溫度的升高而減小,由于熱力作用破壞了多糖分子側鏈間的氫鍵和離子鍵,使多糖的多聚體結構變為低聚體,聚合度的下降導致了粘度下降；SHNP溶液的比濃粘度總體上是隨著其濃度的增大而增大,這可能由于隨著多糖分子含量的增大,分子相互聯結、聚合程度增加,溶液的粘度越大；SHNP溶液的比濃粘度在中性條件下為最大,酸堿性的升高均可使其比粘度減小,這是由于氫離子和氫氧根離子對多糖的側鏈均有一定的破壞作用,使多糖聚合度減小,從而降低了其比粘度;Na+、Ca2+及Mg2+的加入均可使SHNP的比粘度升高,而K+對其影響的程度很小。這說明多糖分子鏈中存在的羥基與某些金屬離子發生絡合作用也會對糖比粘度的有影響。圓二色譜和剛果紅實驗表明：虎奶菇菌核多糖SHNP不具三股螺旋鏈構象,為無規線團鏈構象。隨著溶液環境的變化,SHNP具備不同的存在形態。不同pH溶液,變性劑DSMO(脲)的加入均可使其構象發生改變。

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Research of the solution viscosity and conformation character of polysaccharide from the mushroom sclerotia of pleurotus tuber-regium

LIUA-juan,ZHANGJing*,ZHANGHua-peng,ZHANGPeng,LIANGTao,SUNRun-guang

(College of Food Engineering and Nutrition Science,Shannxi Normal University,Xi’an 710062,China)

Congo-red reaction and the technique of CD were used to observe morphology of polysaccharides(SHNP)from Pleurotus tuber-regium. Inherent viscosity and the particle size distribution changes of the SHNP in different solution were studied to determine conformation of SHNP in solution. The results indicated that:the external conditions such as temperature,pH,denaturants and metal ions etc could affect SHNP to differ extent. The particle size of SHNP became bigger in the addition of NaOH. Congo-red reaction and the technique of CD showed that SHNP did not have the triple helix structure,while it was a random coil chain conformation,pH and denaturants could cause the SHNP conformation change.

polysaccharides;pleurotus tuber-regium；conformation；inherent viscosity;circular dichrosim spectroscopy

2013-03-11 *通訊聯系人

劉阿娟(1986-),女,碩士,主要從事天然產物有效成分的化學研究。

國家自然科學基金(10874108)；陜西省自然科學基礎研究計劃(SJ08A16)資助。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0128-05