杏鮑菇多肽生物活性的研究

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(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太谷 030801)

杏鮑菇多肽生物活性的研究

程菲兒,趙宇宏,趙凡,張曉寶,竇世宏,馮翠萍*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太谷 030801)

杏鮑菇多肽,清除自由基,脂質(zhì)過(guò)氧化,乳化性,抑菌

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 原料 杏鮑菇多肽粗品的制備:利用堿提酸沉法[5-6]提取杏鮑菇蛋白質(zhì),其條件為溫度50℃,pH 12,料液比1∶55,提取時(shí)間2.5h,提取率為46.21%,杏鮑菇蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為3.6。用Sephadex G-100凝膠對(duì)所提取蛋白質(zhì)進(jìn)行純化[7]。洗脫流速,一般為每6min 4～5mL。按文獻(xiàn)8的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定[8]。利用堿性蛋白酶酶解制備多肽,最適水解條件為:pH10.5、溫度45℃、時(shí)間12h、料水比1∶25、酶用量1.0%,在此條件下,杏鮑菇中蛋白質(zhì)的水解度為81.19%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 大腸桿菌(ATCC25922),金黃色葡萄球菌(C56024),沙門(mén)氏菌(CMCC50071),李斯特菌(CMCC54001),志賀氏菌(CMCC51571) 均為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要試劑 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl),Tris 均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;牛肉膏、蛋白胨、鹽酸、氯化鈉、瓊脂、無(wú)水甲醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、氯仿、鄰苯三酚、硫代巴比妥酸、無(wú)水乙醚 以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；2100型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)EPPendorf公司；分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；高速電動(dòng)離心機(jī) 常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；科偉電熱恒溫水浴鍋 北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；PHS-SC型精密酸度計(jì) 上海虹儀儀器儀表有限公司；磁力加熱攪拌器 杭州儀表電機(jī)廠(chǎng)；醫(yī)用型潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多肽對(duì)DPPH·清除作用的測(cè)定 不同濃度的多肽液(2%、1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.06%)各取1mL,分別加入2mL 125μmol/L的DPPH·無(wú)水甲醇溶液,添加無(wú)水甲醇至4mL,充分混合后,在黑暗中放置30min,重復(fù)3組,在517nm下測(cè)定吸光度,得出各濃度多肽對(duì)DPPH·的清除率。

(A0:空白吸光度值；A:517nm下加入樣品的DPPH·的吸光度值；Ab:517nm下加入樣品不加DPPH·的吸光度值)

(ΔA1:鄰苯三酚自氧化時(shí)的反應(yīng)速率；ΔA2:加入樣品液后鄰苯三酚自氧化的反應(yīng)速率)

1.2.3 多肽對(duì)體外脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用的測(cè)定

(Asample:樣品反應(yīng)液吸光值；Ablank:以蒸餾水代替樣品的反應(yīng)液吸光值；Acontrol:未添加硫代巴比妥酸的樣品反應(yīng)液吸光值)

1.2.4 多肽抑菌能力的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用比濁法[9],靈敏度較高,不受杏鮑菇活性物質(zhì)溶解性和擴(kuò)散能力的影響。取無(wú)菌試管,向其中加入9mL杏鮑菇多肽水溶液和乙醇提取液及1mL菌懸液,振蕩使混合均勻充分,設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn),在600nm處定時(shí)測(cè)定其吸光度,以乙醇、無(wú)菌蒸餾水作對(duì)照,找出最大抑菌時(shí)間,同時(shí)以蒸餾水作空白對(duì)照。

(A0:菌懸液的吸光值；A:多肽加菌懸液的吸光值；Ab:多肽的吸光值)

1.2.5 多肽乳化性的測(cè)定 取不同濃度的多肽溶液各0.5mL,加入大豆色拉油各0.5mL,高速攪拌1min(10000r/min),之后分別在0、10min取樣,以0.1%(w/v)SDS(十二烷基硫酸鈉,pH7.0)稀釋100倍,以SDS溶液為空白,做3組平行實(shí)驗(yàn),500nm處測(cè)定吸光度值,以0min的吸光度值(A0)表示乳化活性(EA),乳化穩(wěn)定性用ESI表示:

(A0:0時(shí)刻的吸光值；ΔT:時(shí)間差(min)；ΔA:ΔT內(nèi)的吸光值差)

2 結(jié)果與分析

2.1多肽對(duì)DPPH·自由基清除率的測(cè)定

圖1 不同濃度多肽對(duì)DPPH·自由基的清除作用Fig.1 DPPH· radical-scavenging activities of polypeptides

由圖1可知,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),多肽對(duì)DPPH·自由基的清除率隨濃度增加而增強(qiáng),當(dāng)濃度為2%時(shí),清除率達(dá)85.95%,表明杏鮑菇多肽在一定濃度下具有較顯著的清除DPPH·自由基的能力。

圖2 不同濃度多肽對(duì)超氧陰離子自由基·)的清除作用Fig.2 Scavenging effects of polypeptides on superoxide anion radical

2.3多肽對(duì)體外脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

由圖3可知,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),杏鮑菇多肽對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用隨著多肽濃度的增加而增大,當(dāng)多肽濃度為2%,抑制率達(dá)45.57%,說(shuō)明對(duì)體外脂質(zhì)過(guò)氧化有一定的抑制作用。

圖3 不同濃度多肽對(duì)體外脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig.3 Inhibition of polypeptides on lipid peroxidation at different concentration

2.4杏鮑菇多肽的抑菌作用

圖4 不同濃度多肽對(duì)大腸桿菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of polypeptides on E.coil at different concentration

圖5 不同濃度多肽對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制作用Fig.5 Inhibition of polypeptides on Salmonella at different concentration

圖6 不同濃度多肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 Inhibition of polypeptidies on Staphylococcus aureus at different concentration

不同濃度杏鮑菇多肽對(duì)菌抑制作用如圖4～8所示,經(jīng)過(guò)0.5、12、24、36h后,其吸收光值均呈先上升后下降的趨勢(shì),除李斯特菌在12h達(dá)到最佳抑菌效果,其余均在24h達(dá)到最佳抑菌效果。在相同時(shí)間內(nèi),多肽的濃度增加,抑菌率也隨之增大[10]。可以看出,杏鮑菇多肽有一定的抑菌作用,推測(cè)其抗菌作用主要體現(xiàn)在延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)延滯期,抑制細(xì)菌孢子的萌發(fā),減少微生物在相同時(shí)間內(nèi)繁殖代數(shù),從而抑制菌體的生長(zhǎng)[9]。但該濃度值下的多肽并不能將菌完全抑制,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)菌繁殖生長(zhǎng)的速度大于多肽抑制速度,從而導(dǎo)致其抑菌率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。

圖7 不同濃度多肽對(duì)志賀氏菌的抑制作用Fig.7 Inhibition of polypeptides on Shigella at different concentration

圖8 不同濃度多肽對(duì)李斯特菌的抑制作用Fig.8 Inhibition of polypeptides on Listeria monocytogenes at different concentration

2.5乳化活性(EA)和乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)的測(cè)定

由表1可知,杏鮑菇多肽具有一定的乳化活性和較強(qiáng)的穩(wěn)定性,濃度越高,乳化性越大,而在實(shí)驗(yàn)濃度中,2%的多肽穩(wěn)定性最好。

表1 杏鮑菇多肽乳化性和穩(wěn)定性指數(shù)Table 1 The results of EA and ESA of Pleurotus eryngii polypeptide

3 討論

4 結(jié)論

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[4]張化鵬,張靜,南征.杏鮑菇多糖WPP2的結(jié)構(gòu)表征及抗腫瘤活性[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2013,34(10):2327-2333.

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Study on the biological activity ofPleurotuseryngiipolypeptide

CHENGFei-er,ZHAOYu-hong,ZHAOFan,ZHANGXiao-bao,DOUShi-hong,FENGCui-ping*

(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China)

Pleurotuseryngiipolypeptide;scavenging free radical;lipid peroxidation;emulsibility;bacteriostat

2013-12-16 *通訊聯(lián)系人

程菲兒(1990-)，女，研究生在讀，研究方向：食品科學(xué)。

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130311017-3)。

TS201.4

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001