超高效液相色譜-串聯質譜法測定腐竹中烏洛托品的含量

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(1.北京市產品質量監督檢驗院,北京 101300；2. 北京市食品安全監控和風險評估中心,北京 100041)

超高效液相色譜-串聯質譜法測定腐竹中烏洛托品的含量

吳穎1,張慧1,崔芳1,姜潔2

(1.北京市產品質量監督檢驗院,北京 101300；2. 北京市食品安全監控和風險評估中心,北京 100041)

建立用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)測定腐竹中烏洛托品含量的方法。用乙腈提取腐竹中的烏洛托品,經固相萃取柱PXA凈化,用UPLC-MS/MS分析,采用多反應監測模式,外標法定量。采用ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱,以乙酸銨和乙腈為流動相,進行梯度洗脫。結果表明:該方法標準曲線良好,線性范圍為1～20μg/L,最低檢出限為1μg/L,三個水平添加濃度的平均回收率范圍為81.67%～101.67%。本方法操作簡單快捷,方法準確度和穩定性好。

超高效液相色譜-串聯質譜法,腐竹,烏洛托品,檢測

腐竹是一種人們喜愛的傳統豆制品,但是其保存周期很短,為了使腐竹外表光鮮、保質期長,一些不法廠家在生產的過程中常非法添加硼砂和吊白塊,經過多年的專項治理整頓,已經鮮少見到,但是他們的添加手法和技術也日趨先進和隱蔽,目前監管部門已經發現烏洛托品已經作為吊白塊的替代品添加到腐竹中。

烏洛托品(urotropine),又名六亞甲基四胺(hexamethylenetetramine),本身是屬于低毒類,常應用于醫藥和工業上。作為非法添加物,它主要起到防腐,增白,改善產品外觀的作用,其原理在于烏洛托品在酸性條件下可以分解產生甲醛,對人體的腎、肝、中樞神經、免疫功能、消化系統等均有損害,嚴禁用于食品或食品加工過程中。目前,我國還沒有檢測腐竹中烏洛托品的標準,僅有行業標準SN/T 2226-2008應用于雞肉、雞肝臟、雞腎臟和豬肉中烏洛托品的檢測[1]。相關文獻報道應用于腐竹中的檢測目前已有少數報道,有激光拉曼光譜法[2]、氣相色譜法[3-4]、液相色譜法[5]、和液質聯用法等方法[6-7],因此開展相關檢測工作很有意義。本文建立了腐竹的超高效液相色譜及串聯質譜方法,此方法的開發,可大大減少樣品分析時間。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

烏洛托品標準品 購于sigma公司,純度≥99%。100μg/mL標準品儲備液由乙腈溶解,并置于4℃冰箱中密封保存。色譜純甲醇、乙腈和乙酸銨 購于Dikma公司。實驗用水為超純水。固相萃取柱 購于DIKMA公司的ProElut PXA,規格為150mg/6mL。

Waters ACQULITY UPLC超高效液相色譜儀；Waters Quattro Premier XE質譜儀(Waters,USA)；高速冷凍離心機(SIGMA,德國)；均質機；氮吹儀;ACQULITY UPLC BEH HILIC色譜柱2.1×50mm,1.7μm。

1.2色譜分析條件

液相色譜操作條件:流速:0.3mL/min；柱溫:40℃；進樣體積:10μL；流動相:A為10mmol/L 乙酸銨溶液,B為乙腈；梯度洗脫條件如表1。

表1 液相梯度條件Table 1 Condition of gradient elution

質譜離子源選用電噴霧離子源(ESI)；掃描模式:正離子掃描(ESI+)；檢測方式:多反應檢測；干燥氣:氮氣；離子源溫度:110℃,脫溶劑溫度:350℃,脫溶劑氣:600L/h,錐孔氣:50L/h。質譜分析條件見表2。

表2 質譜分析參數Table 2 Parameter of mass spectra

注:*標注的子離子為定量離子。

1.3標準溶液的配制和曲線繪制

精密稱取烏洛托品1mg溶解于10mL乙腈,配制成濃度為100μg/mL的標準品儲備液,將濃度為100μg/mL的標準品儲備液稀釋100倍,配成濃度為1μg/mL的標準使用液,再配制成工作液,濃度梯度為1,2,5,10,20μg/L,繪制標準曲線。

1.4樣品前處理

1.4.1 提取 稱取1.0g腐竹(精確至0.01g)(已粉碎均勻)和1.0g無水硫酸鈉于聚四氟乙烯離心管中,加入10mL乙腈溶液,渦旋混合2min,超聲10min,10000r/min離心10min,取上清液待凈化。

1.4.2 凈化 將PXA小柱用5mL乙腈活化,將1.4.1中上清液加入柱中,收集流出液(1),再加入1mL乙腈,收集流出液(2),合并流出液,用N2吹干,用90∶10的乙腈∶水溶解定容至1mL,渦旋混勻。過 0.22μm 濾膜,待上機使用。

2 結果與分析

2.1樣品前處理條件的選擇

腐竹樣品采用乙腈提取,是由于烏洛托品在乙腈中溶解度高,可以保證較好的提取效果。凈化過程選用了保留干擾物模式,PXA屬于強陰離子交換小柱,可以很好的吸附脂肪酸類和氨基酸類的雜質,上樣后,烏洛托品在小柱上面沒有保留,隨之流出。本實驗通過氮吹的方式,進行富集濃縮,再用乙腈∶水=90∶10定容,較好的排除了基質的干擾,操作簡便快速,提高了檢測靈敏度和準確性,具備較好的重現性和穩定性。

2.2液相色譜-質譜條件的選擇

BEH HILIC柱是一種可以保留一些強極性物質的色譜柱,這些物質在普通的C18的保留性差或者無保留,有分離效果不好、峰型拖尾等問題,因此本文沒有采用C18柱,選用BEH HILIC色譜柱。本實驗嘗試了含有甲酸的水溶液-乙腈、水-乙腈和含有乙酸銨的水溶液-乙腈進行比較,發現含有乙酸銨的水溶液-乙腈的流動相分離的效果好,峰型對稱。這也是BEH HILIC色譜柱的特性,可以結合高比例有機相/低比例水相組成的流動相來保留目標物質,同時這樣的流動相組成也有利于提高電噴霧離子化質譜(ESI-MS)的靈敏度。在ESI+電離方式下,進行了儀器的毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數的優化選擇。如圖1和圖2分別為烏洛托品的總離子流圖和多反應監測色譜圖,其中圖2分別為是標樣母離子打碎后的選定的兩個碎片離子的圖,定量離子圖和定性離子圖。在樣品中,目標峰可以有很好的響應,和雜峰分離良好。

圖1 總離子流圖Fig.1 Total ionic chromatographic

圖2 多反應監測色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatogram

2.3方法線性范圍、測定低限及精密度

將工作液分別進樣10μL,得到回歸方程(Y為峰面積,X為濃度,μg/L)Y=174.564×X+0.775512,線性相關系數R為0.998,在1～20μg/L濃度范圍內成良好的線性。標準曲線如圖3所示。

圖3 標準曲線Fig.3 Calibration curve

在腐竹空白樣品中添加低、中、高三個含量的烏洛托品,按照方法操作步驟進行回收率實驗,同時每個添加濃度平行重復6次,測定精密度,以S/N≥10計的測定低限和標準偏差結果見表3所示。由表3可以看出,加標回收率在81.67%～101.67%,其多次測定的RSD在1.84%～3.99%,方法的準確度和精密度滿足分析要求。腐竹空白樣品上添加濃度為2μg/L的色譜圖見圖4。

表3 回收率與相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(n=6)

圖4 添加烏洛托品標準品(2μg/L)的多反應監測色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of a sample spiked with urotropine at 2μg/L

3 結論

本研究建立了固相萃取凈化、液質聯用檢測腐竹中烏洛托品含量的方法,實驗結果表明,該方法操作簡單快捷,準確度和穩定性好。應用該法檢測了市場和商超6個不同品牌的腐竹產品,均未發現有烏洛托品的殘留。另外本實驗僅探討了腐竹中的烏洛托品的含量,其余的豆制品的分析尚需進一步探討。

[1]SN/T 2226-2008 進出口動物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測方法液相色譜-質譜/質譜法[S].

[2]張濤,李戰海,李炎,等.非法食品添加劑烏洛托品的拉曼光譜及DFT分析方法[J].檢驗檢疫學刊,2013,(2):36-37.

[3]李薇,陳天科,徐輝,等.烏洛托品的氣相色譜分析[J].分析儀器,2007,(3):29-31.

[4]黃國春.氣相色譜法測定腐竹中烏洛托品含量的研究[J].廣西輕工業,2008,(6):26-27.

[5]李莉,張鋼平.高效液相色譜法測定烏洛托品片的含量[J].中國醫院藥學雜志,2009,(4):335-336.

[6]洗燕萍,陳立偉,羅東輝,等.UPLC-MS/MS測定腐竹和米粉中的烏洛托品[J].江南大學學報(自然科學版),2012,(11):78-82.

[7]陸春良,劉娟,劉向農.親水作用液相色譜電噴霧串聯質譜法測定米線中烏洛托品殘留[J].揚州大學學報:農業與生命科學版,2013,(2):82-86.

Determination of Urotropine in dried beancurd sticks by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WUYing1,ZHANGHui1,CUIFang1,JIANGJie2

(1. Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute;Beijing 101300,China;2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment;Beijing 100041,China;)

A method for the determination of urotropine in dried beancurd sticks was established by UPLC-MS/MS.The sample was extracted with acetonitrile as extraction solvents,then further purified by PXA solid phase extraction column. The analyte was determined by multi-reaction monitoring(MRM)mode was employed for the quantitative determination,and quantified by the external standard curve.The separation was performed on a UPLC ACQUITY BEH HILIC column by gradient elution with a system of water(containing 10mmol/L ammonium acetate buffer)-acetonitrile as mobile phase.Results showed that the calibration curve had good linearity.The developed method exhibited good linearity over the range from 1 to 20μg/L.The minimum detection limit was 1μg/L. The average recovery rate for urotropine was 81.67%～101.67%.The method is simple,accurate and suitable for the identification and quantification.

Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;dried beancurd sticks;urotropine;determination

2014-01-24 *通訊聯系人

吳穎(1965-),女,高級工程師,研究方向:生物化工。

TS

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001